Tfh细胞和B细胞共培养体系与HepG2.2.15细胞相互作用研究

摘要

目前在全球范围内，感染乙型肝炎病毒的人大约有20亿，我国约有9300万人。乙型肝炎病毒严重威胁着人类的健康。慢性乙型肝炎的治疗目前仍然缺乏行之有效的办法和药物。HBV病毒本身不直接破坏肝脏细胞，而肝细胞的损伤主要是由于机体为了清除感染了HBV的肝细胞的免疫反应导致。因此，从免疫学的角度对慢性乙型肝炎的研究仍然具有重要意义。
　　目的
　　以细胞膜受体CXCR5为共同抗原标志，应用免疫磁珠分选法建立Tfh细胞和B细胞共培养体系，在成功构建共培养体系的基础上体外观察培养体系与人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞混合培养前后共刺激因子的变化。为进一步体外研究细胞之间的相互关系奠定基础。
　　方法
　　1.研究对象：慢性乙型肝炎肝硬化行脾切除术患者15例(男8，女7)；
　　2.流式细胞仪检测：获取慢性乙型肝炎肝硬化行脾切除术患者术前外周血20ml，术中取脾脏组织10g左右，分离获得淋巴细胞，以相应的抗体标记，以流式细胞仪检测外周血来源与脾脏来源的Tfh细胞表型；
　　3.以免疫磁珠方法构建Tfh细胞和B细胞共培养体系：采用梯度离心法分离15例慢性乙肝病毒感染者脾脏单个核细胞(PBMC)，以细胞膜受体CXCR5为抗原标志，采用免疫磁珠分选法分离CXCR5+细胞，通过流式细胞仪检测CXCR5+细胞纯度和组成；
　　4.混合培养：将CXCR5+细胞和人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞在体外混合培养1周；
　　5.流式细胞仪检测：CXCR5+细胞和人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞在体外混合培养1周后，应用流式细胞仪检测Tfh细胞表型变化；
　　6.混合培养液上清检测：混合培养1周后，应用ELISA法检测培养上清液HBeAb；
　　7.混合培养液上清HBV DNA水平测定：将收集的上清液经DNA提取液处理后进行PCR扩增，按照HBV DNA荧光定量PCR检测试剂盒操作步骤进行。
　　8.混合培养细胞CXCR5 mRNA水平测定：(1)提取总RNA：按照高纯总RNA快速提取试剂盒说明书进行。(2)合成cDNA：以每10ul反应体系400ng总RNA按逆转录试剂盒说明书进行合成。(3)PCR扩增：CXCR5引物：F：5-CTCCTCTCCATCCACATCACCT-3，R：5-CGTTTCTGCTTGGTTCTCTTGG-3。反应条件为：95℃30S；95℃5S，60℃31S，40个循环。2-△△CT方法分析基因表达水平，B-actin为内参。
　　9.统计学方法：用SPSS17.0软件进行分析，采用t检验和方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果
　　1.同一患者外周血来源的Tfh细胞和脾脏来源的Tfh细胞表型存在差异。外周血来源的Tfh细胞ICOS，PDL1，PDL1表达低于脾脏Tfh细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)，而CCR7表达高于脾脏Tfh细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)：
　　2.同一患者外周血来源的Tfh细胞分泌的细胞因子IFN-γ(8.32±1.21)明显高于脾脏来源的Tfh细胞分泌IFN-γ(3.83±0.32)，差异具有统计学意义(P<0.05)：
　　3.应用磁珠分选法能够成功获得CXCR5+细胞：用流式细胞仪鉴定细胞的纯度和构成：CXCR5+细胞纯度为85.53±5.77％，其中tfh细胞占：23.8±7.4％，B细胞占：35.6±7.6％：
　　4.CXCR5+细胞和人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞在体外混合培养1周后，应用流式细胞仪检测Tfh细胞表型的变化，发现PD1，PDL1，ICOS均明显低于培养前，差异具有统计学意义(P<0.05)。Tfh细胞分泌因子IFN-γ的表达情况也明显高于培养前，差异具有统计学意义CCR7在培养后明显高于培养前和外周血来源的Tfh细胞的表达量，差异具有统计学意义(P<0.05)：
　　5.混合培养1周后上清液HBeAb定量检测结果，实验组HBeAb(0.768±0.094)均高于空白对照组HBeAb(0.478±0.088)，差异具有统计学意义；
　　6.混合培养液上清HBV-DNA定量检测结果：实验组HBV-DNA检测结果明显低于空白对照组，HBV-DNA抑制率为33％；
　　7.将CXCR5+细胞和人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞在体外混合培养l周后，检测CXCR5+细胞表面CXCR5 mRNA的表达情况，实验组和空白对照组相比无显著差异。
　　结论
　　1.脾脏来源的Tfh细胞和外周血来源的Tfh细胞共刺激分子表达存在差异，CXCR5+细胞和人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞混合培养后发现脾脏来源的Tfh细胞细胞表型有向外周血来源的Tfh细胞表型转变的趋势；
　　2.使用间接免疫磁珠分离法可成功建立CXCR5+B淋巴细胞和Tfh细胞的共培养体系，为进一步体外研究细胞之间相互关系奠定基础。
　　3.CXCR5+细胞对HBV-DNA的复制具有抑制作用，HBV-DNA抑制率为33％，对HBsAg，HBeAg也具有抑制作用，通过扩增CXCR5后发现实验组和对照组无明显差异，说明CXCR5+细胞对HBV-DNA复制的影响不是通过高表达CXCR5的途径来实现的，具体的作用机制有待进一步的研究。