当归多糖调控造血干细胞衰老的机制研究

摘要

目的：
　　 成体干细胞是维持组织稳态的重要因素，并在机体衰老进程中起关键作用。造血干细胞(hematopoietic Stem cells，HSCs)是干细胞研究领域中开展最早、技术最成熟、认识最深入并且广泛应用于临床的一种成体干细胞。衰老机体中造血系统基本成分虽然得以维持，但HSCs的功能和数量却逐渐降低，将导致免疫功能衰退和多种老年性疾病的发生。
　　 当归多糖（angelica sinensis polysaccharide，ASP）是从当归中分离、提取的药用有效成分，具有促进造血、抗辐射损伤、抗肿瘤和免疫调节等作用。目前，有关ASP能否延缓HSCs衰老及其作用机制尚不清楚。本研究将干细胞研究技术和祖国传统的抗衰老医学理论相结合，采用HSCs体外衰老模型的复制和X线照射致小鼠HSCs衰老等现代生物学的研究手段，分别从体外与体内两条途径系统地探讨ASP调控HSCs衰老的作用及其可能的生物学机制，旨为重新激活衰老HSCs及调控其靶向分化提供实验依据和理论基础。
　　 方法：
　　 1.免疫磁珠分选技术（magnetic-activated cell sorting，MACS）分离、纯化干细胞抗原-1(Sca-1+) HSCs，流式细胞术测定细胞分选纯度，台酚蓝染色检测细胞活性。
　　 2.采用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法、细胞周期分析、甲基纤维素半固体培养等方法，观察氧化低密度脂蛋白(oxidation lowdensity lipoprotein，ox-LDL)对Sca-1+HSCs衰老生物学特性的影响，以建立ox-LDL体外诱导Sca-1+HSCs衰老模型。
　　 3.ASP与ox-LDL共培养Sca-1+HSCs，采用SA-β-Gal染色、细胞周期分析及甲基纤维素半固体培养观察衰老生物学指标的变化;酶学比色法测定细胞培养上清液超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量;免疫荧光检测Sca-1+HSCs内活性氧(reactive oxygen specie，ROS)水平;荧光定量PCR及Western blot检测Sca-1+HSCs衰老相关基因p16、p21mRNA及细胞周期调控蛋白P16、P21、CDK2、CDK4、cyclinD及cyclinE表达的变化;Southern blot和TRAP-PCR检测Sca-1+HSCs端粒长度与端粒酶活性，以阐明ox-LDL体外诱导Sca-1+HSCs衰老及ASP体外调控Sca-1+HSCs衰老的生物学机制。
　　 4.X线3.0Gy/8F全身均匀照射(total body irradiation，TBI)小鼠，采用SA-β-Gal染色、细胞周期分析、甲基纤维素半固体培养等方法，观察X线TBI对小鼠对Sca-1+HSCs衰老生物学特性的影响，以建立小鼠Sca-1+HSCs体内衰老模型。
　　 5.小鼠X线3.0Gy/8F全身均匀照射期间给予ASP灌胃，采用SA-β-Gal染色、细胞周期分析及甲基纤维素半固体培养观察衰老生物学指标的变化;酶学比色法测定Sca-1+HSCs总抗氧化能力(totalanti-oxidant，T-AOC);免疫荧光检测Sca-1+HSCs内ROS水平;荧光定量PCR及Western blot检测HSCs衰老相关基因p16、p21mRNA及细胞周期调控蛋白P16、P21、CDK2、CDK6、cyclinD及cyclin E表达的变化;Southern blot和TRAP-PCR测定Sca-1+HSCs端粒长度与端粒酶活性，以阐明3.0Gy/8F的X线TBI体内诱导Sca-1+HSCs衰老及ASP体内调控Sca-1+HSCs衰老的生物学机制。
　　 结果：
　　 1.MACS分离纯化后Sca-1+细胞纯度为(86.21±6.17)％，显著高于分离纯化前Sca-1+细胞百分比为(11.45±1.87)％;台盼蓝染色法测定分选的Sca-1+HSCs活性为（93.65±4.54）％。表明分选的Sca-1+HSCs细胞有较高的纯度和良好的活性。
　　 2.ox-LDL体外诱导Sca-1+HSCs呈现典型的衰老生物学表现:SA-β-Gal染色阳性细胞率明显增加;增殖能力明显减弱;G1期细胞比例显著升高、S期细胞比例显著减少;混合集落形成单位(colonyforming unit-mixture，CFU-Mix)数量显著减少。ox-LDL可诱导衰老Sca-1+HSCs培养上清液SOD、GSH-Px活性下降及MDA含量升高;细胞内ROS水平增加;端粒长度缩短，端粒酶活性降低;p16、p21mRNA及蛋白表达增强，CDK4、cyclinD及cyclinE蛋白表达降低，而对CDK2蛋白表达无影响。
　　 3.ASP体外作用于衰老Sca-1+HSCs可降低其SA-β-gal染色阳性细胞率、G1期细胞比例及P16表达;增加S期细胞比例及CDK4、cyclinD蛋白表达;抑制端粒DNA损伤;而对CFU-Mix数量、ROS水平、细胞培养上清液SOD、GSH-Px活性与MDA含量、P21、CDK2、cyclinE蛋白表达及端粒酶活性均无明显影响。
　　 4.X线3.0Gy/8F全身均匀照射诱导小鼠Sca-1+HSCs呈现典型的衰老生物学表现:SA-β-Gal染色阳性细胞率明显增加;G1期细胞比例显著升高，S期细胞比例显著减少;CFU-Mix数量显著减少。3.0Gy/8F的X线可诱导衰老Sca-1+HSCs T-AOC下降，ROS水平增加;端粒长度缩短、端粒酶活性降低;p16、p21 mRNA及蛋白表达增强，CDK6、CyclinD及CyclinE蛋白表达降低，而对CDK2蛋白表达无影响。
　　 5.ASP体内作用于衰老Sca-1+HSCs后可降低其SA-β-gal染色阳性细胞率下降及G1期细胞比例、增加S期细胞比例及CFU-Mix数量;增加细胞T-AOC、降低ROS水平;抑制端粒DNA损伤，增强端粒酶活性;下调p16、p21mRNA及蛋白表达，上调CDK6、CyclinD及CyclinE蛋白表达，CDK2蛋白表达无显著性变化。
　　 结论：
　　 1.MACS可有效分选小鼠Sca-1+HSCs，分离纯化的Sca-1+HSCs纯度较高，活性良好。
　　 2.ox-LDL可作为一种体外复制Sca-1+HSCs衰老模型的有效致衰剂。
　　 3.ASP体外作用可通过调节部分细胞周期调控蛋白表达及抑制端粒DNA损伤延缓ox-LDL诱导的Sca-1+HSCs衰老。
　　 4.3.0Gy/8F的X线全身均匀照射小鼠可诱导Sca-1+HSCs衰老以用于小鼠HSCs体内衰老模型的构建。
　　 5.ASP体内作用可通过抑制氧化应激损伤、调节细胞周期调控蛋白表达、抑制端粒DNA损伤及端粒酶活性下降以延缓X线TBI诱导的小鼠Sca-1+HSCs衰老。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

第一部分 氧化低密度脂蛋白体外诱导造血干细胞衰老及其机制研究

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

参考文献

附图

第二部分 当归多糖体外调控造血干细胞衰老及其机制研究

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

参考文献

附图

第三部分 辐射诱导造血千细胞衰老及其机制研究

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

参考文献

附图

第四部分 当归多糖延缓辐射致造血干细胞衰老的机制研究

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

参考文献

附图

全文总结

文献综述 造血干细胞衰老的分子机制研究

致谢

攻读学位期间参研课题与发表的学术论文