BMP2对H9c2心肌细胞组蛋白乙酰化修饰的调控作用及其机制研究

摘要

本文从以下几方面进行了详细阐述。
　　第一部分:BMP2对H9c2心肌细胞心脏核心转录因子表达及组蛋白乙酰化修饰的调控作用。
　　目的：
　　构建BMP2过表达的心肌细胞模型，检测BMP2对心脏核心转录因子GATA4、MEF2C和Tbx5表达的影响，并研究BMP2对H9c2心肌细胞总组蛋白H3、基因启动子区组蛋白H3乙酰化修饰及组蛋白乙酰化酶(HATs)亚型p300和GCN5的调控作用，以证实我们的科学假设:BMP2是心肌细胞组蛋白乙酰化修饰的上游信号通路之一。
　　方法：
　　(1)过表达BMP2的腺病毒(AdBMP2)及对照空腺病毒(AdGFP)在HEK293细胞中扩增后，分别以不同滴度转染大鼠H9c2心肌细胞，24h后荧光倒置显微镜下观察AdBMP2/AdGFP腺病毒转染细胞绿色荧光蛋白的表达情况，流式细胞术检测AdBMP2/AdGFP腺病毒转染效率。
　　(2) AdBMP2/AdGFP腺病毒转染H9c2心肌细胞24h、48h和72h后收集细胞，提取mRNA，Real-Time qRT-PCR检测各处理组细胞BMP2、MEF2C、GATA4和Tbx5及HATs亚型p300和GCN5的mRNA表达水平，筛选最佳干预时间。
　　(3) AdBMP2/AdGFP腺病毒转染H9c2心肌细胞48h后收集细胞，比色法检测各处理组H9c2心肌细胞核蛋白HATs活性，Western-blotting检测各处理组细胞总组蛋白H3的乙酰化水平，ChIP-Real-Time qPCR检测各处理组细胞MEF2C、GATA4和Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化水平。
　　结果：
　　(1) AdBMP2转染H9c2心肌细胞24h后，荧光倒置显微镜下可见细胞中出现大量绿色荧光，流式细胞术检测结果显示AdBMP2转染效率可达90％以上。
　　(2) AdBMP2转染H9c2心肌细胞24h、48h、72h后，BMP2及心脏核心转录因子MEF2C和GATA4的mRNA表达水平较对照组明显升高(P＜0.05)，并于转染后48h达到高峰，而Tbx5的表达没有明显变化。
　　(3) AdBMP2转染H9c2心肌细胞48h后，HATs亚型p300的mRNA表达水平较对照组升高(P＜0.05)，而GCN5的表达水平与对照组相比没有明显的变化。
　　(4) AdBMP2转染H9c2心肌细胞48h后，细胞核蛋白HATs活性较对照组明显升高(P＜0.05)，总组蛋白H3乙酰化水平也较对照组明显上调(P＜0.05)，MEF2C、GATA4启动子区组蛋白H3乙酰化水平亦相应升高（P＜0.05），但Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化水平与对照组相比未见明显变化。
　　结论：
　　(1) BMP2可上调H9c2心肌细胞中心脏核心转录因子MEF2C和GATA4的表达，而对Tbx5的表达没有影响。
　　(2) BMP2可引起H9c2心肌细胞组蛋白H3高乙酰化，可能是H9c2心肌细胞组蛋白乙酰化修饰的上游信号通路之一。
　　(3) BMP2引起的H9c2心肌细胞组蛋白H3高乙酰化可能与HATs亚型p300有关。
　　(4) BMP2对MEF2C和GATA4启动子区组蛋白H3乙酰化的促进作用可能是BMP2引起MEF2C和GATA4表达上调的机制之一，而Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化未受BMP2的影响可能是Tbx5的表达不受BMP2调控的原因之一。
　　第二部分:p300参与BMP2对H9c2心肌细胞心脏核心转录因子表达及组蛋白乙酰化修饰的调控作用。
　　目的：
　　使用HATs亚型p300的抑制剂姜黄素(Curcumin)来研究p300在BMP2致H9c2心肌细胞心脏核心转录因子GATA4和MEF2C高表达及组蛋白高乙酰化中的作用，以证实我们的科学假设:p300参与BMP2对H9c2心肌细胞心脏核心转录因子表达及组蛋白乙酰化修饰的调控作用。
　　方法：
　　(1) AdBMP2转染H9c2心肌细胞后，用不同浓度的p300 HAT活性抑制剂姜黄素(10μM，20μM，30μM，40μM)处理细胞(6h，12h，24h，48h)，比色法检测各处理组细胞HATs活性，筛选姜黄素最佳处理浓度及时间。
　　(2) AdBMP2和/或姜黄素处理H9c2心肌细胞后，Real-Time qRT-PCR检测各处理组细胞心脏核心转录因子GATA4、MEF2C和Tbx5及HATs亚型p300和GCN5的表达水平，Western-blotting检测各处理组细胞总组蛋白H3的乙酰化水平，ChIP-Real-Time qPCR检测各处理组细胞GATA4、MEF2C和Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化水平。
　　结果：
　　(1)不同浓度(10μM，20μM，30μM，40μM)的姜黄素处理细胞24h后，H9c2心肌细胞的HATs活性明显下降(P＜0.05)，并于40μM达到最低点。40μM姜黄素分别处理细胞6h，12h，24h，48h后，HATs活性于处理后12h达到最低点。
　　(2) AdBMP2和姜黄素共同处理H9c2心肌细胞后，心脏核心转录因子GATA4和MEF2C及HATs亚型p300的mRNA表达水平较单独AdBMP2处理组明显下降（P＜0.05），而Tbx5及GCN5的mRNA表达水平在各处理组之间没有明显的变化。
　　(3) AdBMP2与姜黄素共同处理H9c2心肌细胞后，细胞中总组蛋白H3乙酰化水平及GATA4和MEF2C启动子区组蛋白H3乙酰化水平较单独AdBMP2处理组明显下降(P＜0.05)，而Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化在各处理组之间没有明显的变化。
　　结论：
　　(1)姜黄素可抑制HATs亚型p300的表达，而对GCN5的表达没有影响。
　　(2)在H9c2心肌细胞中，p300 HAT活性抑制剂姜黄素可拮抗BMP2引起的组蛋白H3高乙酰化及GATA4和MEF2C的高表达，说明p300参与BMP2对H9c2心肌细胞GATA4和MEF2C表达及组蛋白乙酰化的调控。
　　(3)在H9c2心肌细胞中，Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化及其表达可能不受p300的调控。
　　第三部分:BMPs参与介导氧化应激反应所致H9c2心肌细胞组蛋白高乙酰化作用。
　　目的：
　　使用BMPs信号通路抑制剂dorsomorphin(DM)来研究BMPs在氧化应激反应所致H9c2心肌细胞组蛋白高乙酰化中的作用，以证实我们的科学假设:BMPs参与介导氧化应激反应所致H9c2心肌细胞组蛋白高乙酰化。
　　方法：
　　(1)不同浓度H2O2(50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM)处理H9c2心肌细胞，24h后采用MTT法检测各处理组细胞的存活率。
　　(2)5μM的BMPs信号通路抑制剂DM和/或适宜浓度的H2O2处理细胞，Real-Time qRT-PCR检测各处理组细胞BMP2及心脏核心转录因子GATA4，MEF2C和Tbx5的表达水平，Western-blotting检测各处理组细胞总组蛋白H3的乙酰化水平。
　　结果：
　　(1)50、100和150μM浓度的H2O2对H9c2心肌细胞的存活率没有明显的影响，200、250、300、350、400和450μM浓度的H2O2处理H9c2心肌细胞后，细胞的存活率分别降低10.5％、16.9％、21.9％、32.4％、47.0％和58.6％。
　　(2)400μM H2O2处理H9c2心肌细胞后，BMP2、GATA4、MEF2C和Tbx5的mRNA表达水平较空白对照组明显升高(P＜0.05)，细胞组蛋白H3的乙酰化水平亦相应升高（P＜0.05）。
　　(3)400μM H2O2和DM共同处理H9c2心肌细胞后，H9c2心肌细胞中总组蛋白H3乙酰化水平较单独400μM H2O2处理组有所下降(P＜0.05)，GATA4和Tbx5的mRNA表达水平也较单独400μM H2O2处理组有所降低(P＜0.05)，而MEF2C的mRNA表达水平较单独400μM H2O2处理组有所升高(P＜0.05)。
　　结论：
　　(1)利用H2O2成功构建H9c2心肌细胞氧化损伤模型。
　　(2)400μM H2O2引起的氧化应激可上调H9c2心肌细胞BMP2、GATA4、MEF2C和Tbx5的表达并引起细胞组蛋白H3高乙酰化。
　　(3) BMPs信号通路抑制剂DM对400μM H2O2引起的氧化应激所致H9c2心肌细胞组蛋白H3高乙酰化及GATA4和Tbx5表达上调具有一定的拮抗作用，说明BMPs（BMP2及其它BMPs亚型）参与介导氧化应激引起的心肌细胞组蛋白高乙酰化及GATA4和Tbx5的高表达，提示在氧化应激的病理状态下，BMPs可能也是心肌细胞组蛋白乙酰化修饰上游信号通路的组成部分，也提示氧化应激可能激活了上调Tbx5表达的BMPs亚型。
　　(4) BMPs信号通路抑制剂DM可引起H9c2心肌细胞MEF2C的表达升高，提示在H9c2心肌细胞中，BMPs各亚型的综合效应可能是对MEF2C的表达起抑制作用，也提示氧化应激可能通过其它信号通路调控MEF2C的表达。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分：BMP2对H9c2心肌细胞心脏核心转录因子表达及组蛋白乙酰化修饰的调控作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二部分：p300参与BMP2对H9c2心肌细胞心脏核心转录因子表达及组蛋白乙酰化修饰的调控作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第三部分：BMPs参与介导氧化应激反应所致H9c2心肌细胞组蛋白高乙酰化作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文总结

文献综述

致谢

攻读学位期间科研情况介绍