线粒体相关活性氧簇及补体活性片段C3a，C5a在淀粉样蛋白β诱导ARPE-19细胞分泌促血管生成细胞因子过程中的作用

摘要

背景：
　　年龄相关性黄斑变性(AMD)是黄斑区结构的衰老病变，多发生于45岁以上人群，其发病机制尚不清楚，是发达国家老年人致盲的主要原因。其主要表现为视网膜色素上皮细胞(RPE)对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，使其潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排出，沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣或者引起Bruch膜断裂，脉络膜毛细血管通过断裂的Bruch膜进入RPE下及视网膜神经上皮下区域，形成脉络膜新生血管(CNV)，导致血管的渗漏和出血，进而引发一系列继发性病理改变。在AMD的早期，RPE为主要靶目标，正常的RPE对于维持眼局部功能及组成血眼屏障(BRB)有重要意义，RPE细胞的功能紊乱可引起光感受器凋亡，在特定条件下还可产生促血管生成因子并最终参与脉络膜新生血管(CNV)的形成，这些血管侵入视网膜将导致中心视力的丧失。玻璃疣是AMD的早期临床标志并沉积于RPE下，玻璃疣刺激RPE细胞分泌促血管生成因子被认为是参与CNV形成的重要原因之一，而作为玻璃疣重要的成分之一，淀粉样蛋白β(Aβ)在该过程中的作用及相关作用机制尚未完全明确。过去的研究已经证明Aβ可以刺激RPE细胞产生活性氧簇，由于氧化应激是促血管生成过程的重要调节因子，而线粒体相关活性氧簇在Aβ诱导的促血管生成过程中是否起作用尚不清楚。另一方面，过去的实验已经证明补体活性片段C3a，C5a也是玻璃疣的重要成分并可以促进RPE细胞分泌促血管生成因子和炎症因子，而玻璃疣中C3a，C5a的产生是否与Aβ有关系，以及它们是否参与了Aβ诱导的新生血管的形成过程也并未进行研究。
　　本研究基于上述背景，进行了以下两大方面的实验:1、探讨Aβ对RPE细胞分泌促血管生成因子的影响，验证其是否引起线粒体相关活性氧簇的上调以及诱导ARPE-19细胞产生补体活性片段C3a，C5a;2、进一步探讨Aβ诱导的活性氧簇及补体片段的产生是否参与了最终促血管生成因子的分泌，探讨Aβ对RPE细胞促血管生成因子影响的相关机制。通过上述研究，以期能对Aβ在AMD发病过程中的作用及相关作用机制有一个较为深入的了解，同时为AMD的预防和治疗寻找到新的靶点和突破口。
　　目的:
　　探讨淀粉样蛋白β对ARPE-19细胞产生促血管生成因子、活性氧簇、补体活性片段C3a，C5a的影响，及淀粉样蛋白β引起的活性氧簇及补体片段C3a，C5a是否参与了其诱导产生促血管生成因子分泌的过程。
　　方法:
　　将由ATCC(American Type Culture Collection)购买的ARPE-19细胞进行细胞培养、传代、种板，分别用不同浓度的Aβ(1-42)、对照反向无活性蛋白Aβ(42-1)及空白对照DMSO刺激24小时，收集培养上清后用ELISA的方法分别检测促血管生成因子VEGF、IL-8、MCP-1的表达水平;使用流式细胞技术检测线粒体相关活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生水平;使用ELISA的方法检测补体活性片段C3a，C5a的表达情况。在用不同浓度的Aβ(1-42)刺激细胞前预先分别加入活性氧阻断剂DPI或者C3a，C5a中和抗体预孵，然后加入刺激剂培养24小时，收集培养上清后用ELISA的方法分别检测相应实验中促血管生成因子VEGF、IL-8、MCP-1的表达水平及补体活性片段C3a，C5a的表达情况。CCK-8实验用以研究Aβ(1-42)和DPI对ARPE-19细胞活性的影响。
　　结果:
　　1.Aβ(1-42)，Aβ(42-1)和DMSO分别处理ARPE-19细胞24小时后检测发现Aβ(1-42)处理组的VEGF，IL-8，MCP-1蛋白表达水平明显高于Aβ(42-1)和DMSO处理组。
　　2.以Aβ(1-42)，Aβ(42-1)和DMSO分别处理ARPE-19细胞24小时后流式检测发现20μ M Aβ(1-42)处理组的线粒体相关活性氧簇有明显升高，而1μM，10μ MAβ(1-42)处理组及Aβ(42-1)和DMSO处理组未发现线粒体相关活性氧簇的明显升高。
　　3.不同浓度的Aβ(1-42)，Aβ(42-1)和DMSO分别处理ARPE-19细胞24小时后收集培养上清进行ELISA检测发现各浓度Aβ(1-42)处理组的C3a，C5a蛋白水平明显高于Aβ(42-1)和DMSO处理组。
　　4.以活性氧阻断剂DPI预处理的Aβ(1-42)刺激组和无DPI预处理的Aβ(1-42)刺激组相比较，其促血管生成因子VEGF，IL-8，MCP-1及补体活性片段C3a，C5a蛋白表达水平明显下降。
　　5.以C3a，C5a中和抗体预处理的不同浓度Aβ(1-42)刺激组和无中和抗体预处理的Aβ(1-42)刺激组相比较，促血管生成因子VEGF，IL-8，MCP-1蛋白表达水平未见明显差异。
　　6.本实验中用到的各浓度Aβ(1-42)对细胞活性无明显影响。5μM的DPI对细胞活性无明显影响，而10μM以上浓度的DPI可明显降低细胞活性。
　　结论:
　　我们的实验结果显示:Aβ通过促进RPE细胞分泌促血管生成因子VEGF, IL-8，MCP-1参与CNV的形成，同时验证了Aβ可诱导ARPE-19细胞产生活性氧簇，分泌补体活性片段C3a，C5a。线粒体相关活性氧簇参与了Aβ诱导的RPE细胞分泌促血管生成因子过程及C3a，C5a的分泌。尽管Aβ可以诱导RPE细胞产生C3a，C5a，但它们并不参与促血管生成因子的形成。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一章 淀粉样蛋白β对ARPE-19细胞促血管生成因子的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二章 淀粉样蛋白β对ARPE-19细胞产生活性氧簇的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三章 淀粉样蛋白β对ARPE-19细胞产生补体活性片段C3a，C5a的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第四章 ARPE-19产生的ROS在淀粉样蛋白β诱导的促血管生成因子及C3a，C5a分泌中的作用

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第五章 ARPE-19细胞分泌的补体片段C3a，C5a在淀粉样蛋白β诱导的促血管生成因子产生过程中的作用

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

总结

研究展望

参考文献

文献综述 淀粉样蛋白β在年龄相关性黄斑变性中作用的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文