基于微滴式数字PCR技术的新型超敏外周血HBV-DNA检测方法的建立及其应用

摘要

目的：基于微滴式数字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技术，建立一种新型超敏的外周血乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA检测方法。评价其特异性与敏感性，并进一步探讨其在慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）患者长期监测和治疗过程中的应用价值。
　　方法:
　　1、将载有HBV-DNA的质粒进行梯度稀释，利用ddPCR检测各浓度梯度的HBV-DNA,来评价ddPCR的准确性和敏感性。
　　2、收集慢性乙型肝炎患者的外周血，利用ddPCR和目前临床常规使用的实时荧光定量PCR（real time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法对比检测，评价其与qRT-PCR相比的优缺点。
　　3、将多个浓度梯度的 HBV-DNA质控品血清，利用QIAamp UltraSens Virus Kit高度浓缩提取后，再进行ddPCR的检测。通过HBV-DNA质控品血清的模拟检测，评价血清经QIAamp UltraSens Virus Kit高度浓缩提取后的ddPCR检测方法在各浓度梯度检测的敏感性和准确性，以及其重复测量的稳定性。
　　4、将血清/血浆内的HBV-DNA高度浓缩后的ddPCR检测方法对临床上抗病毒治疗后外周血HBV-DNA低于检测下限的CHB患者进行随访检查，评价其实际应用的意义与价值。
　　结果：
　　1、通过ddPCR检测各浓度梯度的HBV-DNA质粒，发现ddPCR有较高的敏感性，可检测出单个拷贝的加入量。并且在各浓度的检测与理论值有高度的可重复性和相关性（r=0.997，P=0.000）。在Bland-Altman分析中，可以见到ddPCR在各浓度的检测与理论值相比呈现较高的准确性和一致性，但当加入量为单拷贝或大于105时，其变异性较大。
　　2、在检测临床标本时，ddPCR和qRT-PCR的检测结果存在较高的一致性与相关性（r=0.931，P=0.000）。但在对低病毒载量样本的检测，ddPCR似乎呈现较高的敏感性。
　　3、在质控品的检测试验中，QIAamp UltraSens Virus Kit高度浓缩后ddPCR检测结果与质控的理论值表现有良好的相关性（r=0.993，P=0.000）和一致性。对浓度为0.93log10 IU/mL的质控品检测中，可达到50％的检出率。其他浓度梯度的质控品的检测，检出率为100%。各浓度梯度质控品的重复试验，结果呈现良好的重现性和稳定性，未出现失控的表现。
　　4、利用高度浓缩后ddPCR的检测方法，对临床经抗病毒治疗转阴的患者随访。我们发现无论HBeAg阳性或阴性组的病人中都会出现一部分病人存在或短或长的血清低病毒载量的状态，以及出现少数转阴后的低病毒载量的病毒突破，然而临床上常规的病毒学检测却未能发现这些。
　　结论：
　　1、ddPCR对HBV-DNA的检测呈现良好的准确性和敏感性。
　　2、ddPCR和qRT-PCR对临床样本的检测表现出高度的一致性和相关性。但对低病毒滴度的样本，ddPCR有着较高的敏感性。
　　3、高度浓缩后ddPCR检测方法有着出色的准确性和敏感性，结果的重现性也表现良好。
　　4、高度浓缩后ddPCR检测方法可以发现临床常规检查未能观察到的血清低病毒载量状态，对CHB的长期监测和治疗有着重要的应用价值。