新生儿感染性疾病中NEC肠道菌群致病机制及EOS的感染标志物筛选研究

摘要

第一部分新生儿坏死性小肠结肠炎中肠道菌群变化与致病机制研究 【目的】新生儿坏死性小肠结肠炎（ Neonatal necrotizing enterocolitis; NEC）是威胁新生儿尤其是早产儿的重大疾病;其致病机制尚不完全清楚。目前普遍认为NEC的发生与肠道菌群相关。本研究拟从临床调查入手;探讨NEC患儿肠道菌群及其代谢产物的变化规律;并拟通过体内外试验明确上述变化引发炎症反应的机制;为NEC发病机制提供一种新的可能的解释;为临床治疗提供新的靶点 【方法】 临床标本收集及处理：收集重庆医科大学附属儿童医院NEC手术患儿及确诊的NEC非手术患儿粪便（肠内容物）;同时搜集匹配对照患儿粪便（肠内容物）;采用基于细菌16s rDNA高通量测序的方法分析两组患儿细菌组成差异;利用PICRUSt技术对两组患儿肠道菌群功能进行预测;采用LC-MS与GC-MS平台对两组患儿细菌代谢产物进行分析。针对手术患儿;搜集其肠组织;采用流式细胞技术分析两组患儿肠道固有层调节性 T 细胞（Regulatory T cell;Treg）占CD4+T 细胞比例;采用实时荧光定量 PCR（QPCR）对两组患儿肠道炎症因子进行分析。 体内试验：取新生小鼠分别灌喂PBS及丁酸钠溶液后进行NEC建模;观察两组小鼠体重变化情况;利用 H.E 染色分析两组小鼠肠道组织病理损伤情况;利用流式细胞技术分析肠道Treg表达情况。 体外试验：利用肠道短链脂肪酸（Short chain fatty acid;SCFA）干预小鼠RAW巨噬细胞;利用QPCR及ELISA分析RAW炎症因子受SCFA干预后表达情况。 【结果】临床标本：NEC患儿肠道菌群发生变化;变形菌门增加;厚壁菌门减少;基因功能预测结果显示NEC患儿脂类物质（尤其是丙酸及丁酸）合成能力以及有害异物代谢能力不如对照组患儿（p<0.05）;LC-MS 代谢组学分析结果证实 NEC 患儿与对照组患儿肠内容物代谢产物有明显差异;差异最显著通路为丁酸酯类物质的合成;GC-MS靶向代谢组学结果进一步证实 NEC 患儿肠道乙酸（ 371.4ug/g VS 1242.9ug/g; p=0.01）及丁酸（49.3ug/g VS 107.9ug/g; p=0.02）含量不如对照组患儿。NEC 手术患儿 Treg/CD4+T 细胞比例较对照组患儿低（3.86%VS 8.95%; p=0.01）;肠组织QPCR结果显示;NEC患儿肠组织 IL-10以及 TGF-β 表达减少（p<0.05）;IL-1β、IL-8、TNF-α 升高（p<0.05）。 体内试验：经丁酸处理NEC模型小鼠体重较PBS处理组要高;且肠道病理损伤明显较轻;小肠及结肠Treg占CD4+T细胞比例较高。 体外试验：SCFAs处理RAW巨噬细胞结果显示;相较于PBS处理组; QPCR及ELISA实验均表明丁酸组 IL-10及TGF-β较对照组高;差别有统计学意义（p<0.05）。 【结论】肠道菌群在NEC发病中有重要作用;其可能机制为NEC患儿肠道厚壁菌门减少;引起其代谢产物 SCFA 减少;进而导致肠道巨噬细胞分泌IL-10及TGF-β降低;引起Treg细胞表达减少;从而引起炎症。 第二部分 新生儿EOS的感染标志物筛选研究 【目的】新生儿早发败血症（Early onset sepsis;EOS）仍然是威胁新生儿生命的首要原因;由于其发病早;临床表现不明显;血培养阳性率低导致其诊断较为困难。传统的感染标志物如WBC、CRP等在新生儿早发败血症中的价值有限;临床上亟待新的感染标志物帮助EOS 诊断。本项研究拟通过高通量多因子检测评判一系列常见及罕见感染标志物在诊断EOS中的价值。 【方法】本研究前瞻性的纳入 151 例怀疑新生儿败血症的患儿;然后依据其围产期高危因素、临床表现、实验室非特异性检查将其分为了感染组及非感染组;利用 Luminex 200 高通量蛋白检测系统检测IL-27; IL-6; IL-8; TNF-α; 热休克蛋白(Hot shock protein; HSP) 70; 巨噬细胞炎症蛋白（Macrophage inflammatory protein ;MIP）-1α; MIP-1β; 颗粒 酶 B （ granzyme B ） ; 以 及 基 质 金 属 蛋 白 酶 （ Matrix metalloprotease;MMP）-8等炎症因子;采用化学免疫发光法检测PCT。利用受试者工作曲线（Receiver operating characteristic;ROC）评判每个感染标志物的诊断价值;利用多元logistic回归模型探寻EOS的独立危险因素。 【结果】：最终纳入研究的 151 例患儿中;高度疑似组有68例;低度疑似组有 83 例。在所有感染标志物中;IL-27 具有最高的诊断效能(p<0.01);其ROC曲线下面积为0.747;诊断节点为1 ng/ml;此时;其灵敏度为70.59%;特异度为71.08%。此外;IL-6、TNF-α、HSP 70、MMP-8、PCT以及CRP在两组中都有明显差异;即在感染组中升高明显;而IL-8; granzyme B、MIP-1α以及MIP-1β在两组中无统计学差异。多元logistic回归发现PCT以及IL-27是众多感染标志物中独立的预测标志物;联用PCT以及IL-27可以明显提高诊断效能。 【结论】IL-27 是一个有效的 EOS 诊断标志物;联用 IL-27 以及PCT能够较大程度提高EOS的诊断效率。

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