动物食品中兽药残留AlphaLISA检测方法研究

摘要

动物食品是人类饮食中常见且是最重要的一类食物。这类食物的原料是各种动物身上可食用的肉和组织，经过不同方法不同程度的加工，成为各种各样的肉类食品。常见的肉类包括猪肉、牛肉、鱼肉等。这些肉类食品营养丰富，吸收率高，滋味鲜美，可提供人体所必需的氮基酸、无机盐、脂肪酸和维生素等物质。近年来人们对于肉类食品的需求在不断增加，价格也随之持续增长。但是，鱼类在生长过程中易受到细菌侵袭，水产养殖户使用孔雀石绿治理寄生虫、真菌或细菌感染。畜类的生长周期较长，瘦肉率不高。部分养殖专业户就使用玉米赤霉醇、β-受体激动剂等药物，以此来提高瘦肉率，减少脂肪含量，缩短出栏时间。这些药物通常被添加在饲料中，或者是以耳根埋植的形式用到畜类身上，易造成兽药物残留。
　　孔雀石绿特别是其代谢产物在水产动物体内有明显的高残留及高毒性，可产生三致(致畸、致癌和致突变)等副作用；玉米赤霉醇残留在体内会引起人体性激素功能紊乱及影响第二性征的正常发育，在外部因素诱导下，可能会导致癌症的发生。玉米赤霉醇排出动物体外后，还可经饮水和食物造成二次污染及环境污染；β－受体激动剂以超过治疗剂量5-10倍的用量用于家畜饲养时，易在动物脏器中积聚残留，并通过食物链进入人体，摄入过量会导致心悸、头疼、恶心，甚至损害肝肾。为了保护消费者的健康，中国、欧盟等国家都禁止使用这些兽药。
　　人们评价兽药已经不再局限于它对肉类食品在经济上带来的效益，而更注重于它无损害环境和健康的社会效益。因此，肉类食品中兽药残留的检测有着极其重要的意义。现在用于兽药检测的方法有HPLC，MS/MS-HPLC，ELISA等，但是这些方法都有一定的不足（例如不能大规模筛选检测，成本高等）。由此，多种类兽药的检测、低检测限、大规模筛选检测成了发展的需求，这不仅可以保障肉类食品的质量安全，还可以减少人力、财力、物力的大量损耗等。在本文中，建立了一种高效，快速且灵敏的筛选检测方法，用于动物食品中兽药的残留检测1。
　　第一部分、水产品中孔雀石绿AlphaLISA检测方法的建立
　　目的:建立孔雀石绿(Malachite green，MG)的光激化学发光纳米均相时间分辨荧光免疫法(AlphaLISA)分析方法。
　　方法：将待测物，生物素化-MG-BSA，抗体加入到孔板中，再加入供体微珠和受体微珠，用AlphaLISA仪检测。
　　结果：结果表明该方法特异性良好，与无色孔雀石绿，无色结晶紫无交叉反应，灵敏度为0.42ng/mL，MG在两种鱼样品中的回收率在81.0%～105.0%和84.0%～90.8%之间，批内RSD<9.5%，批间RSD<16.0%。
　　结论：MG–AlphaLISA方法可以简单、快速的对鱼类进行MG测定，具有特异性强、灵敏度高、稳定等特点。
　　第二部分、AlphaLISA法检测肌肉组织中玉米赤霉醇和玉米赤霉烯酮
　　目的：采用均相光致化学发光免疫分析法（AlphaLISA）检测肌肉组织样品中玉米赤霉醇和玉米赤霉烯酮。
　　方法：以猪肉和牛肉为原料，样品经过乙酸钠、β-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶提取，HLB柱净化，采用AlphaLISA法检测。
　　结果：该方法显示出在0.01-4ng/mL范围内有一个良好的线性关系（R2>0.99)，灵敏度为0.066ng/mL。玉米赤霉醇的交叉反应率为100％，玉米赤霉酮交叉反应率为82.1％，和其它化合物的交叉反应率小于40％。在1-4ng/mL添加水平下，玉米赤霉醇猪肉和牛肉的平均回收率分别为96.3％＞105.0％，91.7％～100.5％，RSD<17.5％。
　　结论：结果表明，该方法适用于肌肉组织中玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的残留检测。
　　第三部分、猪肉中β-受体激动剂(克伦特罗，沙丁胺醇，溴布特罗，特布他林)AlphaLISA检测方法的建立
　　目的：建立了快速检测猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗和特布他林4种β-受体激动剂的光激化学发光纳米均相时间分辨荧光免疫(AlphaLISA)分析方法。
　　方法：以猪肉为原料，样品经乙酸铵和β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶酶解提取过柱，浓缩至干后，用缓冲溶液定容。样品与生物素化抗原、抗体、供体微珠和受体微珠进行酶联免疫，AlphaLISA进行检测。
　　结果：沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗和特布他林在0.1～500ng/mL范围内呈良好线性，R2均>0.98，沙丁胺醇与克伦特罗、溴布特罗和特布他林的交叉反应率分别为143.3%，179.2%和95.6%，灵敏度范围为0.03~0.08ng/mL。在0.5，10，20μg/kg3个添加水平下，4种化合物的平均回收率为82.5%～115.9%，RSD<12.0%。
　　结论：该方法操作简单，快速准确，适用于猪肉中β-受体激动剂的筛选与检测。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

第一部分水产品中孔雀石绿AlphaLISA检测方法的建立

1 材料和方法

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二部分 AlphaLISA法检测肌肉组织中玉米赤霉醇和玉米赤霉烯酮

1 仪器与材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第三部分 猪肉中β-受体激动剂AlphaLISA检测方法的建立

1 仪器与材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

全文总结

参考文献

文献综述：AlphaLISA技术的研究进展

致谢

硕士期间发表的论文

参加的课题