法医线粒体全测序在二代测序平台的建立及亚人群效应的评估

摘要

线粒体DNA分型技术，在法医遗传学中有着不可忽视和无法替代的作用。特别是在降解检材，母系亲缘鉴定上发挥着常染色体 STR（Short Tandem Repeats，短串联重复序列）的重要补充作用。但是，线粒体DNA相对较低的识别力，一直是其最大的缺点。现在，新一代测序技术(Massively Parallel Sequencing, MPS)的出现，使高识别力的线粒体全基因组（mtGenome）检验在日常法医应用中成为可能。除此之外，线粒体DNA的证据效力是建立在良好的参考人群数据库上的。而我国广阔的地理分布以及多民族的特点，使得亚人群效应无法忽视。所以不同人群之间的线粒体分布差异会对法医工作有着多大的影响，是评估建设全基因组数据库的关键之一。 在我们的课题中，采用长片段测序策略对重庆地区47个汉族个体进行了基于PGM（Personal Genome Machine）测序平台的测序以及Ion Torrent Software Suite（Vs5.0）数据处理包进行处理。而后，对其产生的测序结果进行系统发生学以及一代测序的方法进行验证。并通过不同测序区域对法医相关参数的计算来展示全基因组测序对证据效力的提升。 另外，我们收集了现有的符合法医学要求的线粒体全基因组序列数据，并进行了进一步整理和地域分析。采用的方法包括计算两两地区间的FST值，AMOVA分析以及主成分分析（PCA），用来进一步明确我国线粒体的分布特征。并对不同人群差异所造成的释然比不同进行了评估，由此来反应亚人群效应的影响。 结果，每个样本仅消耗了2μl（＜20ng）的 DNA，便取得了平均1000×以上的测序结果。随机匹配概率降低了7%，并将稀有单倍型的匹配概率提高了20倍，极大限度的提高了测序效率和识别力，节约了珍贵的样本。在与一代测序方法的重复测序部分对比中，结果的一致性也在99%以上。但是，PGM也并不完美。本实验所观察到假阴性位点和多聚物区测序依然是新技术的薄弱点。此测序方法和软件仍然有需要提升的空间。所以对于现有PGM产生的数据，后验的质控和一代测序的验证是不可缺少的，并且在进行法医学的比对时，仅使用 VCF文件进行比较可能会出现错误。 在人群差异的调查中，其差异的程度也显然与地理位置相关。地理位置相互靠近的汉族人群间的差异没有统计学意义，而差异程度随着地理位置的增加而增加。另外，南北方人群与北方人群之间的差异明显，并且南方人群内部的多态性也是有统计意义的。除此之外，东部沿海和内陆地区的区别也有统计学意义的。 在亚人群效应的评估中，即使同为南方汉族，沿海与内陆差异也可能引起20倍以上的释然比之差。所以，仅仅将我国汉族分为南部和北部是不适合的。除此之外，在人群分布规律的调查时，有的南方城市表现出了北方地区人群的特点，反之亦然。这些情况与各地的移民历史等因素相关，这对于数据库的建立也是一个需要考虑的因素。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分法医线粒体全测序在二代测序平台的建立

1线粒体DNA

2线粒体DNA的法医学应用

3新一代测序技术

4实验方法

5实验结果

6小结与展望

第二部分线粒体全基因组的亚人群效应评估

1线粒体的人群多态性

2实验方法

3结果

4小结与展望

参考文献

综述:二代测序技术在法医学中的应用及其未来展望

致谢

攻读博士学位期间发表的论文