植物疫害生物分子检验检疫技术研究与固相化检测试剂盒研制

摘要

本博士论文针对国内外植物疫害生物急需相应检疫检验技术体系和快速检测试剂（盒）的现状，选择严重影响农业生产安全的柑桔溃疡病菌、亚洲柑桔韧皮部杆菌、小麦矮腥黑穗菌和马铃薯种传病毒等为靶标疫害微生物，依据专有基因序列设计特异性引物/探针，利用简易快速、高效排抑的膜分离样品制备方法，建立了靶标疫害微生物特异、准确的免疫诊断和PCR检验检疫技术体系，并基于独创的生物大分子稳定剂创制新型固相化分子诊断试剂盒，并用于近缘种类的甄别、田间病害早期诊断和疫情动态监测。对于增强我国防范农业植物外来疫害入侵和扩散的检疫监控能力，提高我国农业植物疫害生物检验检疫技术整体水平，确保中国农产品的安全生产，促进中国农产品顺利出口具有重要意义。 (1) 柑桔溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. Citri, Xac）引起的柑桔溃疡病是严重影响全世界柑桔生产的重大检疫性病害。本研究选择Xac独有蛋白基因序列分别设计筛选出特异性引物对(JYF5/JYR5)，建立了柑桔溃疡病菌常规PCR检测技术，经反复测试结果表明能够稳定地特异性检出柑桔组织表面所带溃疡病菌的DNA靶带(413 bp)。而对柑桔叶面附生的非致病性黄单胞菌、野油菜黄单胞菌等近缘种以及健康柑桔样品都不能扩增出该靶带；靶细菌DNA检测下限为1.56 pg/μL，细菌悬浮液检测下限为10 cfu/μL；在不同PCR仪及各种控温方式下都能稳定地扩增出特征性靶带，说明该检测技术已经成熟稳定。以插入Xac靶序列片段的重组质粒DNA或溃疡病菌菌液或显症材料作为阳性对照样品，以盆栽柑桔实生苗作为阴性对照样品，利用建立的PCR技术和固相化检测试剂盒对南方柑桔主产区的柑桔叶片、枝条和果实样品统一制样进行了实际检测，结果与各地实际病害发生一致。 (2) 柑桔黄龙病（Citrus Huanglongbing, HLB）由难以人工培养的韧皮部杆状细菌所引起，是严重影响世界柑桔产业的重要检疫性细菌病害之一。该病可以通过罹病接穗嫁接、带菌柑桔木虱（Diaphorina citri）取食健株新梢以及罹病柑桔种苗远距离传播。利用克隆测序的16S rDNA核糖体蛋白基因序列片段比对分析，设计靶序列特异引物对和荧光探针，建立并优化了柑桔黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus）的常规PCR、荧光染料和TaqMan探针定量PCR反应体系，分别测评了检测特异性、灵敏度以及准确度，结果表明TaqMan探针PCR对于靶标病原菌的检测特异性最强，但检测成本较高；SYBR Green I 染料法的检测灵敏度最高，常规PCR、TaqMan探针法、SYBR Green I 染料法对靶片段序列DNA的检测下限依次为43.90 fg/μl、4.39 fg/μl、0.44 fg/μl，定量PCR检测灵敏度较常规PCR高出至少1－2个数量级。对来自6省市果园送检的显症或无症柑桔组织样品进行实际检测，结果表明基于特异引物对的常规PCR和TaqMan探针的实时荧光定量PCR，都可以快速准确地检出疫害生物的靶标序列片段，TaqMan探针法检出率更高。 (3) 小麦矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa Kühn, TCK）引起的小麦矮腥黑穗病（Wheat dwarf bunt disease），是麦类腥黑穗病中危害最大、极难防治的国内外检疫性病害之一。TCK与其近缘种小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries Tul，TCT）在冬孢子形态学、ITS基因水平上都具有很高的同源性，国内外利用18S rDNA的转录间区序列分析、随机多态性DAN 扩增、Rep-PCR、基因指纹图谱等方法寻找TCK种内及种间差异的努力，一直未能成功。 本博士论文采用RAPD引物介导的半特异性PCR法（RAPD primer mediated semi-specific PCR, RM-PCR）筛选TCK的端粒相关序列。根据端粒DNA（Telomere sequence）保守重复序列TTAGGG和端粒相关序列（Telomere associated-sequence, TAS）的高度多态性特点，将带有锚定碱基的端粒特异性引物（5’CCCTAACCCTAACCCWAA 3’）和RAPD随机引物结合，扩增端粒相关序列（TAS）。采用不对称复性温度PCR方法，高严谨循环和低严谨循环交替进行，使端粒重复序列特异引物扩增的特异性产物产量远远超过RAPD单引物扩增的非特异性产物。通过变换随机单引物，筛选出TCK与TCT不同的端粒相关序列，并将筛选的4个特异性端粒相关序列克隆测序，经与国际上三大基因文库BLASTn联网比对分析序列同源性，选出与其他已知真菌的同源性都很低的TCK特征性差异序列片段（1322bp），并据此设计两对特异引物CQUTCK1/CQUTCK2和CQUTCK3/CQUTCK4，分别以制备的TCK和TCT的冬孢子或菌丝体DNA为模板，采用降落PCR（Touch down PCR, TD-PCR）扩增验证了引物特异性，结果表明，在供试TCK所有菌株中，两对引物均能扩增出预期的目标DNA谱带，而TCT菌株中则无相同的DNA扩增产物，证实靶标片段确为TCK的特异基因序列片段，引物对具有很高的特异性，可用于TCK和TCT分子水平的快速鉴定。本研究成果解决了专化性TCK分子检疫检验技术体系的建立和检测试剂盒的研制中的关键技术难题。已获准登陆NCBI基因文库（GenBank，Accession No: DQ266258）。 (4) 引致马铃薯品种退化、产量下降的PLRV、PVX、PVY、PVA、PVS以及PSTVd等多种病毒是我国马铃薯产区的主要有害生物，工厂化组培马铃薯种苗和各级种薯品质的检定和田间复合侵染马铃薯病害的种类鉴定都需要快速准确的分子检验技术。利用筛选的Triton X-100和Na2SO3 病毒释放剂，直接从组织中提取马铃薯ssRNA病毒的简易浸提法，优化反转录靶标病毒下游引物比例、PCR扩增的复性温度、Mg2＋和dNTPs浓度的基础上，建立了比一步法灵敏度更高而且稳定的两步法多重RT-PCR检测体系，该检测体系同DSA－ELISA相比灵敏度高约100倍。研制了两步法多重RT-PCR固相化检测试剂盒。采用多重RT-PCR检测试剂盒对来自四川、重庆等15县市248个苗圃与大田的显症或无症马铃薯种薯（苗）样品实际检测，都能正确检测出植株所带病毒。为马铃薯病毒病快速鉴定和田间病害早期诊断提供了分子检测技术和实用工具，适合于省级植保部门和脱毒种薯育苗单位以及科研部门推广使用。 (5) 病害分子检测中，阳性对照的缺乏和不准确是影响检测标准化和准确性的重要因素。同时使用活体微生物作为阳性对照还存在有害生物扩散的危险，加热灭活的菌液因保存期限短，不宜作为阳性对照。本研究将以特异性引物扩增的DNA片段克隆测序，确认特异性后经克隆转化，建立了疫害生物的重组质粒DNA阳性参照品，为病害检测标准化提供了技术支撑，确保检测的准确性和可比性，避免了检测过程中检疫性有害生物在环境中的二次扩散。 (6) 基于上述靶标疫害生物的特异性引物/探针，优化的相应分子检测方法、反应条件和试剂配方，加入专有的生物活性分子稳定剂经过预混分装，预冻后经真空冷冻干燥后制成固相化检测试剂盒。经反复测试表明固相化试剂盒可以在常温条件下密封保存至少半年,检测稳定性、灵敏度和特异性等各项技术指标均无明显改变。试剂盒即开即用，操作简单，利于检测标准化，适用于大量样品的检测。目前已研制出的系列固相化试剂盒包括柑桔溃疡病菌、柑桔黄龙病菌小麦矮腥黒穗菌的PCR固相化检测试剂盒；SGI荧光染料和TaqMan水解探针定量PCR固相化检测试剂盒；马铃薯病毒多重－RT－PCR检测试剂盒。已经用于国内外相关疫害生物各种送检或采集样品的实际检验检疫。已申报4项检测技术与固相化试剂盒发明专利（附录C）。