聚（D，L-乳酸）基仿生细胞外基质的骨组织工程基质材料研究

摘要

“材料仿生修饰/工程”是第三代医用生物材料研究的热点。为了克服可降解医用生物材料聚乳酸的临床使用缺陷和满足其在生物医学工程领域的使用要求，本研究在以D,L-丙交酯(DL-LA)为原料，采用新型共引发体系合成高分子量聚(D,L-乳酸)(DL-PLA)的基础上，通过一系列化学改性来制备一种新型聚乳酸基仿生细胞外基质材料。采用多角度激光光散射仪(MALLS)、傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)、核磁共振波谱仪(NMR)、X射线光电子能谱仪(XPS)、差示扫描量热计(DSC)、氨基酸分析仪(AAA)和常规化学分析方法等手段对所得材料进行结构表征和性能测试，并详细考察了其亲/疏水性、体外生物可降解性和生物相容性。主要研究内容和结论如下： (1)以D,L-丙交酯为原料，采用由Sn(Oct)2引发剂和自制的助引发剂共同组成的新型共引发体系来制备高分子量聚(D,L-乳酸)，重点考察了助引发剂在体系中的作用效果、助引发剂用量对产物分子量的影响以及共引发机理。 ①FTIR、13CNMR、1HNMR和XPS的分析结果表明，采用该共引发体系能合成制备出DL-PLA材料；DSC分析显示合成得到的DL-PLA的玻璃化转变峰值温度为63.6℃。 ②MALLS的检测结果表明，在一定的浓度范围内，该共引发体系能明显加快聚合反应速率，缩短聚合反应时间，并且其用量也是影响产物分子量和分子量分布的重要因素。 ③回归分析的结果表明，与对照组不加助引发剂体系所得产物分子量的最大值仅为116,600相比，由S拟合得到的添加助引发剂体系的产物分子量极限值为153,300。因此，通过合理控制共引发体系中引发剂和助引发剂的用量，就可以得到高分子量的DL-PLA。 (2)根据“材料整体仿生修饰”新思路，本研究将高分子量聚(D,L-乳酸)先用马来酸酐(MA)改性，再用脂肪族二胺(DA)改性，后用生物活性多肽(RGDS)改性，从而制备了一种新型仿生聚乳酸基质材料。其中，马来酸酐的引入主要是给材料提供高反应活性的酸酐键；二胺的引入主要是为了克服聚乳酸材料降解产物呈酸性的缺陷；而活性肽RGDS的引入则主要是为了赋予材料生物活性和给材料提供生物特异性。 ①FTIR、13CNMR和XPS的分析结果表明，在不影响DL-PLA材料主链结构的前提下，利用其分子结构中叔碳原子的自由基反应活性，在引发剂过氧化二苯甲酰(BPO)的作用下，能成功地将MA引入高分子量DL-PLA的分子骨架中，从而制备出MA改性聚乳酸(MPLA)材料。 ②采用正交实验优化后的MPLA合成条件是：反应时间10h、反应温度80℃、引发剂BPO用量3wt﹪(相对于MA用量)；利用罗丹明比色法和MALLS分别测定MPLA中MA的接枝率和产物分子量，结果表明，当投料中MA用量分别为5﹪、10﹪和20﹪时，合成得到的MPLA材料中MA所占的质量百分含量分别为1.61﹪、2.58﹪和3.16﹪；而相对于初始DL-PLA的分子量(Mw=132,800)，合成得到的MPLA的分子量(Mw)分别下降了2.86﹪、10.77﹪和28.24﹪。 ③FTIR、13CNMR和XPS的分析结果表明，利用脂肪族二胺与MPLA中的酸酐基团发生N-酰化反应这一特点，能将丁二胺(BDA)引入到MPLA的酸酐分子骨架中，从而得到二胺改性聚乳酸(DPLA)材料； ④茚三酮显色法测定DPLA材料中BDA的含量并计算接枝率，结果表明，当MPLA材料中的MA含量分别为1.61﹪和2.58﹪时，合成得到的DPLA材料中BDA所占的质量百分含量分别为1.37﹪和2.20﹪； ⑤在缩合剂N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)的作用下，生物活性多肽RGDS可通过与DPLA材料之间形成酰胺键而被共价结合到DL-PLA的分子骨架中，从而制备出新型仿生聚乳酸(BPLA)材料；AAA的检测结果表明，该多肽在BPLA材料中的平均含量是5.12μmol/g，其接枝效率是22.4﹪。 (3)考察了聚(D,L-乳酸)及其仿生材料的理化性能，主要包括材料的亲/疏水性能和降解性能。其中，亲/疏水性的评价指标是静态水接触角(滴液法接触角)和吸水率，降解性能的评价采用体外实时降解试验。结果表明： ①四种材料静态水接触角的大小依次为：MPLA＞DL-PLA＞DPLA＞BPLA，吸水率的大小依次为：BPLA＞DPLA＞MPLA＞DL-PLA，这说明BPLA材料具有最佳的亲水性，DPLA次之，提示这两种材料可望成为具有良好亲水性和生物相容性的医用生物材料。 ②DL-PLA和MPLA材料在降解前期其介质的pH值下降较快，pH值变化速率较高，这两种材料呈现明显的酸致自催化降解现象；而DPLA材料在降解过程中其介质的pH值基本趋于恒定，pH值变化速率始终不超过0.3pH/周，并且随DPLA中BDA含量的增加，其介质的pH值下降速度趋缓，说明脂肪族二胺的引入达到了预期的实验目的。 (4)将材料与大鼠成骨细胞在体外复合培养，以考察材料的生物相容性，检测指标主要包括：细胞形态(SEM观察)、粘附力和铺展面积(微管吸吮系统测定)、增殖能力(MTT法测定)、分化能力(以碱性磷酸酶表示)、矿化能力(钙比色法测试)等。结果表明： ①与对照组DL-PLA材料相比，各项检测指标均显示成骨细胞在DPLA材料薄膜上具有更好的细胞相容性，这主要是因为随着MA和BDA在聚乳酸骨架中的引入，使得DPLA材料中出现了丰富的氨基和羧基，这些基团通过调节材料表面的亲-疏水性质和表面荷电性能，从而影响并调节材料表面的蛋白质吸附能力，进而促进细胞的粘附和生长。 ②与DPLA和对照组DL-PLA材料相比，成骨细胞在BPLA材料薄膜上具有更好的细胞相容性，主要表现在细胞形态饱满，粘附和铺展状况良好，细胞增殖、分化和矿化能力显著增强等，这说明由生物活性多肽RGDS介导的细胞与基底之间的特异性相互作用在这里起了决定性作用。上述结果提示，BPLA是一种具有良好细胞相容性的医用生物材料，可望在生物医学领域尤其是组织工程领域获得广泛的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要缩略词

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1 绪论

1.1 问题的提出及研究意义

1.2 国内外研究现状

1.2.1 仿生材料研究现状

1.2.2 聚乳酸材料仿生化研究现状

1.3 本文的研究目的和主要研究内容

1.4 本论文的创新点

2 聚（D，L-乳酸）的合成与表征

2.1 前言

2.2 聚（D，L-乳酸）的制备与纯化

2.2.1 合成原理

2.2.2 主要材料与设备

2.2.3 合成与纯化方法

2.3 聚（D，L-乳酸）的分析表征

2.3.1 分子量和分子量分布的测定

2.3.2 红外吸收光谱分析

2.3.3 核磁共振谱分析

2.3.4 X射线光电子能谱分析

2.3.5 玻璃化转变温度的测定

2.4 实验结果

2.4.1 助引发剂的作用效果

2.4.2 助引发剂用量对DL-PLA分子量的影响

2.4.3 DL-PLA的红外吸收光谱分析

2.4.4 DL-PLA的核磁共振谱分析

2.4.5 DL-PLA的X射线光电子能谱分析

2.4.6 DL-PLA分子量和分子量分布的测定结果

2.4.7 DL-PLA玻璃化转变温度的测定结果

2.5 讨论

2.5.1 DL-PLA结构确定

2.5.2 DL-PLA聚合过程中Sn(Oct)2的作用

2.5.3 助引发剂的作用

2.5.4 引发剂和助引发剂在体系中的相互用作关系

2.5.5 引发剂-助经发剂体系的反应规律探讨

2.6 小结

3 聚（D，L-乳酸）基仿生材料的构建

3.1 前言

3.2 聚（D，L-乳酸）基仿生材料的制备与纯化

3.2.1 构建路线

3.2.2 主要材料与试剂

3.2.3 主要仪器与设备

3.2.4 MPLA的合成

3.2.5 DPLA的合成

3.2.6 BPLA的合成

3.3 聚（D，L-乳酸）基仿生材料的分析表征

3.3.1 红外吸收光谱分析

3.3.2 核磁共振谱分析

3.3.3 X射线光电子能谱分析

3.3.4 分子量和分子量分布的测定

3.3.5 马来酸酐含量的测定

3.3.6 丁二胺含量的测定

3.3.7 RGDS含量的测定

3.4 实验结果

3.4.1 材料红外吸收光谱分析

3.4.2 材料核磁共振谱分析

3.4.3 材料X射线光电子能谱分析

3.4.4 MPLA反应条件的优化

3.4.5 MPLA分子量和分子量分布的测定

3.4.6 DPLA中丁二胺含量的测定

3.4.7 BPLA中RGDS含量的测定

3.5 讨论

3.5.1 MPLA的合成

3.5.2 DPLA的合成

3.5.3 BPLA的合成

3.6 小结

4 聚（D，L-乳酸）基仿生材料的理化性能研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 主要材料与设备

4.2.2 材料薄膜的制备

4.2.3 静态水接触角的测定

4.2.4 吸水率的测定

4.2.5 降解实验模型的建立

4.2.6 降解性能的测定

4.3 实验结果

4.3.1 静态水接触和吸水率的测定结果

4.3.2 降解性能的测定结果

4.4 讨论

4.4.1 聚乳酸的亲/疏水性能

4.4.2 聚乳酸的生物降解性能

4.5 小结

5 聚（D，L-乳酸）基仿生材料的生物相容性评价

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 主要材料与方法

5.2.2 主要仪器与设备

5.2.3 细胞培养与鉴定

5.2.4 材料薄膜的制备

5.2.5 DL-PLA基仿生材料对成骨细胞形态的影响

5.2.6 DL-PLA基仿生材料对成骨细胞粘附和铺展的影响

5.2.7 DL-PLA基仿生材料对成骨细胞增殖能力的影响

5.2.8 DL-PLA基仿生材料对成骨细胞分化的影响

5.2.9 DL-PLA基仿生材料对成骨细胞矿化的影响

5.2.10 统计分析

5.3 实验结果

5.3.1 原代培养和传代培养细胞形态

5.3.2 培养细胞表型鉴定

5.3.3 成骨细胞在材料表面的形态

5.3.4 细胞粘附与铺展

5.3.5 细胞增殖能力

5.3.6 细胞分化能力

5.3.7 细胞矿化能力

5.4 讨论

5.4.1 生物相容性评价方法的选择

5.4.2 生物材料生物相容性的影响因素

5.4.3 细胞/材料相互作用

5.4.4 粘附肽RGDS的生物活性

5.5 小结

6 主要结论与后续工作建议

6.1 主要结论

6.2 后续工作建议

致 谢

参考文献

文献综述:RGD modified biomimetic polymeric materials

附录1 作者在攻读博士学位期间科研及发表论文情况