PDMS微通道内金属微点上DNA固定技术研究

摘要

微流控技术(microfluidics)由于可望实现大大降低试剂消耗，缩短反应时间，减少费用，众多的集成潜力，正在成为新一代生物分析技术的重要推动力。结合微流控的原理与技术方式是当前包括基因芯片在内的生物微阵列技术发展的一个重要技术方向。为了实现DNA微阵列技术与微流控方式的融合，将DNA探针固定到微流控芯片的最基本组件——微通道中，是一个首要的重要步骤。
　　 微通道加工技术，在常规上是利用光刻工艺及其随后兴起的软刻技术(softlithography)来实现的。所以常规的微阵列与微流控结合方式，总伴随着要对敞开微通道的闭合步骤，这对许多生物分析步骤带来许多不利的后果。
　　 本文在基于软刻策略的微丝模塑加工微通道的技术基础上，通过十字交叉方式的处理工艺，直接一次成型地在微通道内构建出金属微点及其阵列，为克服微阵列与微流控方式结合中常规需要作后端闭合处理的缺陷提供了重要条件。本文也由此出发，讨论的重点即是如何在这样形成的微通道内壁的微点上来实施DNA探针的固定，并通过杂交过程来检验固定过程的可靠性。
　　 微通道内DNA固定实验采取了三种方式：巯基DNA探针与金微点的共价结合，DNA探针在微通道内作为电极的不锈钢微点上的吸附，DNA探针在微通道内经聚吡咯修饰的电极上的固定。
　　 结果发现：(1)在微通道内的DNA-FAM与金微点上固定经过16小时的孵育，48小时固定，随后与HS-DNA作用5小时即有肉眼可见的荧光微点出现，这表明在微通道内的杂交时间明显缩短。(2)在直流电作用下，带有负电荷HS-DNA-FAM在微通道内不锈钢微点电极上的吸附没有按照预想情况出现在阳极端，相反却出现在阴极微点表面，由电吸附形成的阴极荧光微点的强度与微点面积大小，DNA浓度，电解质浓度，电极之间的距离及通电时间有关。①在20微米直径的微通道中，始终没有出现可见的荧光微点，40，60，80，100μm不锈钢丝交叉点的面积与阴极电极吸附的DNA的荧光强度成正比。②在其他条件恒定的情况下，随着DNA浓度在0.00305-12.5nmol/ml之间逐渐增加时，不锈钢微点上电吸附的ssDNA微点荧光强度在持续增大，但是在大于0.78125nmol/ml后影响微小。当DNA浓度在0.00305nmol/ml时由于DNA浓度过小，难以在较短时间内在不锈钢微点上形成有效地肉眼可见的DNA荧光微点。③在其他条件恒定的情况下NaCL浓度在0.063-0.25mol/L之间逐渐增加时，不锈钢微点上电吸附的ssDNA微点荧光强度在持续增大，但是在大于0.25mol/L后影响微小。当NaCL浓度在0.063mol/L时，难以在50s在不锈钢微点上形成有效地肉眼可见的DNA荧光。④在其他条件恒定的情况下，电极间距逐渐增加时，不锈钢微点上电吸附的ssDNA微点荧光强度不断持续减小，电极间距逐大于520微米后在不锈钢微点上难以形成有效的肉眼可见的DNA荧光微点。⑤在其他条件恒定的情况下，随着通电时间在0-200s之间逐渐增加时，不锈钢微点上电吸附的ssDNA微点荧光强度在持续增大。在可控的第6秒时，即有可见荧光微点出现，但是在大于100s后荧光强度变化影响微小。(3)在微通道内的不锈钢微点表面铺上一层无交联剂的PDMS后，通过电化学方法把(10个伏安循环，20分钟)聚吡咯修饰在微点表面，同时固定靶DNA，随后进行温度差异，及杂交与非杂交过程导致的伏安循环电流变化(10个伏安循环，20分钟)，结果显示在最适温度条件下，其电流信号增大了32.03倍，而在室温条件下仅增大了3.51倍；有杂交行为出现时，其电流信号较基础电流净增大了127.273倍；而无杂交行为出现时，其电流信号较基础电流仅仅净增大了21.4倍。
　　 在三种实验比较中，在微通道内在金微点表面DNA固定时间最长，与互补链杂交的形成所需时间也最长，但是仍旧比在开放液池条件下杂交要快得多。在电吸附试验中，FAM-DNA-HS在最短可控的第6秒既有可见荧光微点出现，但是需要用直流电维持，并且对其后的杂交试验造成了不利影响。在通过聚吡咯固定DNA所需时间介于以上两种试验之间，也仅需20分钟，杂交时间仅20分钟，速度较快。
　　 综上，本文在PDMS微通道内构建的金属微点电极上成功地实施了DNA探针的固定的三种实验方式，并对其中两种方式通过杂交效果来加以进一步证实。其结果提示了一种在微通道内DNA固定与杂交结果无标记检测方式的集成，也初步提示了一种微流控方式与微点阵列集成的雏形。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1问题的提出及研究意义

1.2 DNA微阵列概述

1.2.1 DNA微阵列的概念

1.2.2 DNA微阵列的技术原理及制作

1.2.3 DNA微阵列的制作方法

1.2.4 DNA微阵列的类型

1.3微分析系统及微流控芯片概述

1.3.1微阵列(生物)芯片

1.3.2微流控芯片

1.3.3微流控分析芯片的发展状况

1.3.4微芯片的检测方法

1.3.5微流控芯片的进样技术

1.3.6微流控芯片的材料和特点

2 DNA固定的国内外研究现状

2.1基底材料的种类

2.2 DNA在固体表面的固定

2.3 DNA平面固体基质表面的固定

2.3.1 DNA在玻片和硅片表面的共价键固定

2.3.2玻片经过介质包被后在介质表面固定DNA

2.3.3 DNA在塑料表面的固定

2.3.4 DNA在纤维素膜上的的固定

2.3.5 DNA在金片上的固定

2.3.6 DNA通过生物素亲和素固定

2.3.7 DNA在PDMS上的固定

2.3.8 DNA在PMMA(poly(methyl methacrylate))上的固定

2.3.9 DNA通过(P(GMA-r-2-AOEMA)在多种基质表面的固定

2.3.10 DNA在磁纳米粒子表面的固定

2.4 DNA平面固体基质表面的非共价键固定

2.4.1在多聚赖氨酸包被的玻璃基片表面固定DNA

2.4.2 DNA在硝酸纤维素和尼龙上的固定

2.4.3 DNA在玻片表面上的非共价键固定

2.4.4通过sol-gel混合物的陷捕作用把DNA固定在玻片表面

2.5 DNA在电极表面的固定

2.5.1 DNA直接在电极固体基质表面的共价键固定

2.5.2 DNA通过聚合物膜键间接固定在电极固体基质表面

3 PDMS微通道内金属微点及微阵列的构建

3.1在微通道内构建金属微点的目的

3.2实验方案

3.2.1试剂与仪器

3.2.2实验步骤

3.3微点的几何表征

4 DNA在PDMS微通道内微金点上的固定及杂交

4.1在微通道内微小金点上固定DNA的目的

4.2实验方案

4.2.1试剂与仪器

4.2.2试验步骤

4.3结果

4.4讨论

5 DNA在PDMS微通道内不锈钢微点上的电吸附

5.1在微通道内微小金属裸点上固定DNA的目的

5.2实验方案

5.2.1试剂与仪器

5.2.2试验步骤

5.3 DNA在PDMS微通道内不锈钢丝裸点处及液池中的电吸附

5.3.1微通道内的单个不锈钢微点上的DNA电吸附

5.3.2在同一微通道内多个微上的DNA电吸附

5.3.3在同一微通道内金属微点上无加载电压时的DNA吸附情况

5.3.4在开放液池中直流电对DNA的吸附

5.4微通道直径，DNA浓度，NaCL浓度，电极间距离对DNA电吸附的影响

5.4.1不同直径锈钢丝交叉点孔径大小对直流电吸附FAM-ssDNA-SH的影响

5.4.2通电时间对直流电吸附FAM-ssDNA-SH的影响

5.4.3电极间距对直流电吸附FAM-ssDNA-SH的影响

5.4.4 DNA浓度对直流电吸附FAM-ssDNA-SH的影响

5.4.5 NaCL浓度对直流电吸附FAM-ssDNA-SH的影响

5.5讨论

6 DNA在经聚吡咯修饰的微通道内不锈钢微点上的固定与杂交

6.1在经聚吡咯修饰的微通道内不锈钢微点上的固定DNA与杂交的目的与意义

6.2实验方案

6.2.1试剂与仪器

6.2.2试验步骤

6.3试验结果

6.3.1微通道内温度对ssDNA杂交后伏安循环电流变化的影响

6.3.2相同条件作用下ssDNA杂交后的电流变化与非互补ssDNA作用后电流变化的影响比较

7结论与展望

7.1论文完成的主要工作以及创新点

7.1.1在微通道内微点阵列加工及其流控特征方面

7.1.2在微通道内微点上DNA固定方面

7.2进一步的研究目标

致 谢

参考文献

附录 攻读硕士期间发表论文