蝉花中多球壳菌素类长链碱的测定方法学研究及代谢轮廓分析

摘要

蝉花(Cordyceps cicadae)是我国传统的一种名贵中药材，与冬虫夏草同属虫菌复合体，且具有相近的药用价值，所以医家常将蝉花作为冬虫夏草的代用品。蝉花的主要活性成分之一是多球壳菌素(myriocin，ISP-1)，多球壳菌素除具有较强的免疫抑制活性，还具有抗动脉粥样硬化、抗真菌等药理作用。
　　 ISP-1在野生和人工蝉花药材的含量很低，这也是产业化的瓶颈。目前人们以期通过蝉花发酵的方法提高其产量。因此，建立多球壳菌素类长链碱的检测和评价方法并优化蝉花菌发酵生产多球壳菌素具有十分重要的现实意义。本论文以蝉花为研究对象，建立了一套多球壳菌素分析技术平台；建立了同时测定蝉花中四种多球壳菌素类长链碱(myriocin-like long-chain bases，MLB)的方法；对蝉花鞘氨醇类长链碱(sphingoid long-chain bases，SLB)进行了代谢轮廓分析。主要内容及结论如下：
　　 1、蝉花中多球壳菌素含量低、成分复杂，检测困难。本论文选择固相萃取(solidphase extract，SPE)进行样品的纯化，考察了萃取小柱种类、上样量、洗脱和解析溶剂等因素对ISP-1净化的影响。建立了SPE-HPLC分析蝉花多球壳菌素方法，结果表明该方法简便易行、重现性好，可用于蝉花中ISP-1含量的测定，其中ISP-1的平均回收率为98.95％，RSD为2.22％。同时运用质谱验证了样品中的目标成分与多球壳菌素一致性，并根据碎片荷质比(m/z)推测了ISP-1分子离子的合理裂解方式。
　　 2、由于ISP-1没有特征吸收基团，采用紫外检测器检测，选择性和灵敏度较低。为此，探索并建立了一个多球壳菌-9-氯甲酸芴甲酯(Fmoc-Cl)的反应体系，以吡啶溶解的ISP-1与四氢呋喃为溶剂的Fmoc-Cl在40℃反应10 min为优化的反应条件。运用MS技术对Fmoc-Cl与ISP-1的衍生物的结构进行了分析，推断出ISP-1与Fmoc-Cl发生衍生化反应同时ISP-1的分子内发生了内酯化反应。考察了衍生剂的浓度、反应温度、反应时间等因素对ISP-1衍生物形成的影响及多球壳菌素衍生物的稳定性。以Fmoc-Cl为衍生化试剂，构建了一个多球壳菌素柱前衍生并采用紫外检测的HPLC分析系统。定量限和检测限分别为0.102μg/mL、0.045μg/mL，线性范围为2.0～500.0μg/mL。采用此方法对天然和人工蝉花中多球壳菌素进行了分析，结果显示天然蝉花中多球壳菌素的含量远远低于人工蝉花。
　　 3、ISP-1与鞘氨醇(sphingosine，So)、植物鞘氨醇(phytosphingosine，Phy)和二氢鞘氨醇(sphinganine，Sa)均属MLB，具有重要的生理作用。为此，建立了邻苯二甲醛(o-phthalic aldehyde，OPA)柱前衍生-HPLC-UV同时分析这四种MLB的方法。采用LC-MS技术分析了ISP-1、Phy、So和Sa衍生物的结构，并推测其质谱裂解途径。考察了衍生化反应体系中缓冲盐浓度和pH、OPA量、2-巯基乙醇量、衍生反应时间、衍生反应温度等因素对四种MLB衍生物形成的影响及稳定性。结果发现控制反应温度，2-巯基乙醇能够选择性参与邻苯二甲醛与ISP-1的反应。该方法检测性能指标为：检出限分别为1.7、1.2、1.4和0.9μg/mL；加样回收率都大于96％；日内和日间精密度的RSD小于4.0％。优化的样品水解条件为：水解温度110℃、水解时间16 h、溶剂量4 mL。采用此方法对6种不同碳源的蝉花样品中四种MLB进行了分析，结果显示平均含量最高的ISP-1、So、Sa都分布在蔗糖组(340.19μg/g，124.02μg/g，387.84μg/g)，而Phy在麦芽糖组(407.78μg/g)。
　　 4、为了阐明蝉花中ISP-1与SLB相关性，利用OPA柱前衍生-HPLC-UV-MS技术，开展蝉花SLB代谢轮廓分析。精密度、重现性、稳定性等3项试验里10个色谱峰的保留时间和峰面积的RSD分别低于1.7％和4.5％。获取24个菌丝体样品的峰面积，经主成分分析模式识别，提取了2个主成分，其累积贡献率分别为79.16％和13.06％。蝉花SLB代谢轮廓分析的结论为：主成分得分图能够区分ISP-1不同含量的6个碳源组；2个主成分与ISP-1的含量曾负相关；所分析的10个变量(色谱峰)在组间的差异有统计学意义。经LC-MS、文献和网上数据库的分子量筛选，8种SLB被推断。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照表

声明

1 绪 论

1.1蝉花的研究进展

1.1.1引言

1.1.2蝉花化学成分及药理作用

1.1.3研究开发的现状

1.2鞘脂代谢及生理作用

1.2.1鞘脂的结构和代谢

1.2.2鞘脂类对细胞的生理作用

1.3代谢组学研究的现状

1.3.1代谢组学的定义

1.3.2代谢组学的研究内容

1.3.3代谢组学的技术平台

1.3.4代谢组学数据处理技术

1.3.5代谢组学应用

1.4课题研究的意义、论文的主要内容

1.4.1课题研究的意义

1.4.2论文的主要内容

2 SPE-HPLC测定蝉花多球壳菌素的含量

2.1前言

2.2实验部分

2.2.1试药、试剂与材料

2.2.2仪器与设备

2.2.3蝉花深层发酵培养

2.2.4对照品和供试品溶液的制备

2.2.5色谱条件

2.2.6质谱条件

2.3结果与讨论

2.3.1测定波长的选择

2.3.2样品制备的优化

2.3.3多球壳菌素纯度检查及质谱分析

2.3.4方法学考察

2.3.5应用

2.4本章小结

3柱前衍生化HPLC-UV测定多球壳菌素含量

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1试药、试剂与材料

3.2.2仪器与设备

3.2.3溶液的配制及供试品溶液的制备

3.2.4衍生化反应

3.2.5色谱条件

3.2.6质谱条件

3.3结果与讨论

3.3.1色谱条件的优化

3.3.2衍生条件的优化

3.3.3检测波长的选择和质谱分析

3.3.4方法学考察

3.3.5方法的应用

3.4小结

4柱前衍生化HPLC-UV同时测定四种多球壳菌素长链碱含量

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1试药、试剂与材料

4.2.2仪器与设备

4.2.3溶液的配制及供试品溶液的制备

4.2.4衍生化反应

4.2.5色谱条件

4.2.6质谱条什

4.3结果与讨论

4.3.1反应体系的建立及衍生产物结构研究

4.3.2色谱条件的优化

4.3.3测定波长的选择

4.3.4.紫外和荧光检测器灵敏度的比较

4.3.5样品预处理方法的建立

4.3.6方法学考察

4.3.8不同探源的样品分析

4.4小结

5蝉花鞘氨醇类长链碱代谢轮廓分析

5.1引言

5.2实验部分

5.2.1试药、试剂与材料

5.2.2仪器

5.2.3溶液的配制及供试品溶液的制备

5.2.4衍生化反应

5.2.5色谱条件

5.2.6质谱条件

5.3结果与讨论

5.3.1鞘氨醇类长链碱色谱峰

5.3.2方法学考察

5.3.3数据的处理

5.3.4主成分分析

5.3.5鞘氨醇类长链碱结构研究

5.4小结

6结论与展望

6.1结论

6.2创新点

6.3问题和展望

致 谢

参考文献

附 录