基于模拟微血流状设计药物筛选模型的初步研究

摘要

近十几年来新药的数量呈现出逐渐下降的趋势，面对着周期长、成本高且成功率低的迫切问题，何种策略对新药研发是行之有效的，一直是个争论不休的话题。尽管有大量的活性物质在体外筛选中被发现，然而令人费解的是很多在体外药理活性高的化合物一旦在进入动物或临床试验后往往药效差强人意，这也就导致了许多候选药物在后期研发中被淘汰。然而，引起这种活性差异的原因仍然是一个“黑匣子”，这也成为了现代药物研发中关注的焦点，是值得我们深入探究的问题。
　　 药物在体外筛选与体内发挥作用的真实环境差异可能是其中的原因之一，一个最明显区别就是体外的静态筛选与体内的动态环境之差。药物进入体内一般会经过吸收、分布、代谢等过程来发挥作用，然而这些过程都与血液循环系统密切相关，特别是微循环系统作为机体进行物质交换的场所，它是否在引起这种体内外药物活性差异中扮演着什么重要角色。基于此，本实验以内皮细胞为研究对象，丹参为模型药物，借助于流动腔加载以实现模拟在体微血流的流动环境，拟初步建立一种动态的药物筛选方法，以考察动态筛选与静态筛选之间是否存在细胞对药物吸收和代谢的差异。生物力学及生物力药理学的迅速发展为提出一种新的动态筛选策略提供了强大的理论依据。
　　 本课题的主要研究内容和实验结果如下所示：
　　 ①基于在体微血管的生理环境(1～5dyn/cm2剪切力直接作用于内皮细胞)，建立了一套体外模拟微血流的系统，由平板流动腔、恒流泵、硅胶管和储液瓶构成。该系统能提供二维稳定的分散状层流。通过对流动系统的校正，得到恒流泵各转速与对应的流体流量之间呈现出良好的线性关系，相关系数r为0.999。采用乌氏粘度计测得灌流液在37℃下的粘度为6.684x10-3dyn·s/cm2，并根据剪切力公式，拟合恒流泵各转速与对应剪切力之间良好的线性关系，相关系数r=0.999。并推算出实验所需的微血流剪切力τ=1.5 dyn/cm2，3.0 dyn/cm2和4.5dyn/cm2时，对应的转速分别为0.18rpm，0.28rpm和0.38rpm。
　　 ②以丹参提取物作为模型药物，考察了不同浓度的丹参提取物(15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)对内皮细胞活力的影响，实验结果表明100μg/mL～400μg/mL对细胞活力有显著影响，并在100μg/mL达到最大活力119.50％，相对于正常对照组活力提高了19.50％。将丹参提取物原液进行LC-MS分析，发现12个物质峰，通过分析质谱数据及参考丹参成分的相关文献，从中推断出11个成分，包括丹参素、丹酚酸A、丹酚酸J、咖啡酸、二氢丹参酮Ⅰ、丹酚酸B、迷迭香酸甲酯、丹酚酸D、原儿茶醛、亚甲基丹参醌和迷迭香酸，以及一个未知成分。通过对给药后静态模型和动态模型的细胞解离液进行LC-MS检测，发现它们都对丹参素、二氢丹参酮Ⅰ、咖啡酸、丹酚酸B、亚甲基丹参醌、丹酚酸D和丹酚酸A这7个成分有吸收，这些成分可能与血管活性的功效有关；另外，与静态模型相比，在动态模型的细胞解离液中，发现一个未知成分峰，通过与空白细胞解离液和药材原液谱图比较均未发现，推测其可能是药物与细胞在微血流条件下作用后产生的某种代谢物。在微血流的给药时间梯度(1h、2h、3h)考察下，动态模型均对这7个成分有吸收，而且在不同加载时间的作用下于不同时间各出现一个未知成分峰，通过谱图对比，推测这些未知成分可能为代谢物。由此可见，相对于静态细胞模型来说，在微血流拟态下，细胞对药物的吸收代谢是有影响的，并且随着药物作用时间的增加，对其吸收代谢会产生不同的影响。
　　 ③通过考察静态模型(τ=0)、恒流模型(τ=1.5dyn/cm2)和梯度流模型(τ=1.5-3.0-4.5 dyn/cm2)三种不同给药情况下，细胞对药物吸收代谢的影响，结果发现它们均对丹参提取物中的7个成分有吸收，包括丹参素、二氢丹参酮Ⅰ、咖啡酸、丹酚酸B、亚甲基丹参醌、丹酚酸D和丹酚酸A。然而在恒流模型中出现1个未知成分峰，在梯度流模型的细胞解离液中发现了3个未知成分峰，通过与空白细胞解离液和药材原液谱图比较均未发现，推测这些未知成分可能为药物与细胞在微血流条件下作用后产生的某种代谢物，而静态模型没有未知成分峰的出现。由此可推断，与静态相比较，在微血流条件下动态的药物筛选环境会影响细胞对药物的吸收代谢，并且梯度流的剪切力这种影响作用更明显。
　　 ④通过考察H2O2不同浓度(75μmol/L、150μmol/L、300μmol/L、600μmol/L、1200μmol/L)作用于内皮细胞不同时间(0.5h、1h、2h)，结果发现H2O2300μmol/L～1200μmol/L让细胞活性明显下降，与正常对照组比较均有显著性差异(P<0.05)，其中300μmol/L的H2O2刺激0.5h，细胞活性抑制率达到27.94％，以此建立氧化损伤模型。在一定的实验浓度范围，考察了不同浓度的丹参提取物(15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)对内皮细胞的抗氧化效应，研究表明200μg/mL的丹参提取物对细胞的保护作用最强，细胞活性达到了113.64％。基于上述实验，在微血流拟态下观察到经200μg/mL丹参提取物预处理后再与H2O2作用的细胞，其形态比损伤组有较明显的改善，说明动态模型筛选丹参中抗氧化活性成分是可行的，并且丹参提取物在动态和静态培养下对细胞的保护作用还是有差异的。在动态模型下，从细胞解离液中，分析鉴定出5个丹参活性成分，包括丹参素、丹酚酸B、丹酚酸D、咖啡酸、二氢丹参酮Ⅰ，和2个未知成分峰；而静态模型中，只有4个成分被细胞吸收，比动态少了二氢丹参酮Ⅰ的吸收和1个未知成分峰，通过与空白细胞解离液和药材原液对比，推断这些未知成分可能为代谢产物。可见，与静态环境相比，微血流拟态的流动环境的确会对细胞与药物的相互作用产生影响，表现为药物吸收和代谢的变化，由此说明体内的微血流环境在引起药物体内外活性差异中起到一定的作用。本课题的完成将为建立更高效、准确的药物筛选模型奠定基础，具有重要的意义。