针对HBV S基因的反义锁核苷酸体外抑制乙型肝炎病毒表达的研究

摘要

背景与目的：乙型肝炎病毒感染是引起急性、慢性乙型肝炎的主要原因，并与肝硬化、肝癌的发生发展有着密切关系，严重威胁着人类健康。目前临床上使用的药物专一性不高，易引起乙肝病毒变异等缺点，对乙肝的疗效不理想。随着分子生物学的蓬勃发展，从基因水平上探索一条治疗乙肝的新途径具有重大意义。锁核苷酸(Lockednucleicacid，LNA)是近几年发展起来的一种强有力的新型核酸替代物，本课题旨在探讨针对HBVS基因翻译起始区的反义锁核苷酸片断体外抑制乙型肝炎病毒表达的作用，评价锁核酸抗HBV基因治疗的可行性。 方法：以乙型肝炎病毒全基因组转染的人肝癌细胞系HepG22.2.15(2.2.15)为实验对象： 1.2.2.15细胞鉴定：分别用酶联免疫吸附法(ELISA)、PCR和免疫细胞化学方法对2.2.15细胞功能活性及HBV抗原亚型进行鉴定。 2.ASON的设计：设计并合成互补于HBVmRNAS基因翻译起始位点(155～165nt)的11聚反义寡脱氧核苷酸(ASON)，分别进行LNA修饰(序列Ⅰ)、磷酸硫代化修饰(序列Ⅲ)和未修饰(序列Ⅱ)，同时设计合成与HBV基因的无关序列(序列Ⅳ)为对照。 3.确定给药剂量：以2.2.15细胞接种96孔板，培养24h后，分别加入不同浓度(1、5、10μM)的序列Ⅰ和Ⅳ，设不含药物的细胞为对照，72h后，ELISA法检测细胞培养上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的含量，选择最佳药物浓度。 4.抗原抑制率检测：序列Ⅰ～Ⅳ以10μM一次性作用于2.2.15细胞，每隔24h收集细胞上清液，连续6d，用ELISA法动态检测上清液中HBsAg含量变化，观察比较不同修饰方式的ASON对HBsAg抑制的效果。 5.基因水平检测：序列Ⅰ、序列Ⅲ以10μM作用于2.2.15细胞，设不加药物的细胞为对照，72h后，提取细胞上清及细胞内的HBVDNA，用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法进行定量分析。 6.毒性检测：四甲基偶氮唑盐微量酶反应(MTT法)检测LNA对细胞代谢的影响，活细胞计数(台盼兰染色)、细胞形态学观察等了解LNA对培养细胞的毒性作用。 结果：1.HepG22.2.15细胞能持续分泌表达HBsAg；PCR扩增表明细胞培养上清液中含有HBVDNA，2.2.15细胞整合的HBV基因为ayw亚型；免疫细胞化学染色HBsAg呈阳性。 2.序列Ⅰ和序列Ⅳ作用细胞72h后，以10μM的序列Ⅰ即LNA对HBsAg的抑制作用最佳(P＜0.01)，抑制率为47.21％。序列Ⅳ无明显抑制作用。 3.针对HBVS区的ASON均可不同程度抑制2.2.15细胞分泌HBsAg(P＜0.005)。作用第三天(3d)出现抑制高峰，此后随时间延长作用减弱。序列Ⅰ第3d抑制率可达51.19％，抑制效果比序列Ⅱ、Ⅲ强。序列Ⅳ对HBV抗原表达的抑制率最高为8.87％，无明显时效关系。 4.FQ-PCR检测结果显示细胞及培养上清中HBVDNA均为阳性。序列Ⅰ、序列Ⅲ均能有效地抑制HBVDNA的合成。与对照组相比，差异有明显统计学意义(P＜0.01)。组间两两比较差异有显著意义(P＜0.05)，提示LNA抗病毒作用优于反义硫代寡核苷酸。 5.LNA对2.2.15细胞代谢活性的影响：LNA各浓度组与对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。LNA在20μM浓度范围对宿主细胞无毒性。 结论：1.HepG22.2.15具有良好的HBV表达活性，可作为抗HBV药物筛选的研究模型。 2.针对HBVS基因翻译起始区的反义锁核苷酸片断体外能有效抑制HBV基因的表达且对细胞代谢无影响。LNA抗HBV作用比未修饰和全硫代修饰的反义寡核苷酸强。LNA为乙肝的分子治疗开辟了新的途径。

目录

主要英文缩写

前 言

第一部分HepG22.2.15细胞培养及乙型肝炎病毒的检测

第二部分反义寡脱氧核苷酸抗乙型肝炎病毒实验

讨 论

结 论

展 望

附：已发表文章

参考文献

致 谢