耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a转肽酶区的表达、抗体制备及胶乳凝集检测方法的建立

摘要

目的PCR扩增编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistantstaphylococcusaureus，MRSA)青霉素结合蛋白2a(penicillinbindingprotein2a，PBP2a)转肽酶区的mecA基因片段，构建其原核表达载体，在大肠杆菌中获得高效表达，并制备相应的多克隆抗体，初步建立检测PBP2a的免疫学方法，为进一步制备抗PBP2a单克隆抗体并开发试剂盒奠定基础。 方法1、根据基因文库登录的mecA基因的编码序列，设计合成了一对含有酶切位点的寡核苷酸引物，应用PCR技术从MRSA基因组DNA中扩增获得编码PBP2a转肽酶区的DNA片段，酶切后将此目的基因片段连接至经过相同酶切的PET-His载体上，经酶切鉴定、测序正确后，转化E.coliBL2l(DE3)plysS，用IPTG诱导重组蛋白的表达，并进行表达条件的优化。然后利用Ni2+亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白，并对表达的重组蛋白以进口商品化MRSA胶乳凝集试剂盒进行鉴定。 2、以纯化的目的蛋白为免疫原免疫新西兰大白兔，获得抗PBP2a转肽酶区的多克隆抗体，对抗血清进行纯化，间接ELISA及Westernblot方法检测制备第3页的抗血清效价和特异性，并初步建立检测PBP2a的胶乳凝集试验。 结果1、PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见在DNA分子量标准1000bp附近有一清晰的扩增条带，与目的片段预期大小一致；重组质粒经BamHI、EcoRⅠ双酶切，产物在预期大小处出现条带，表明目的基因已插入载体PET-His中；序列分析表明，重组质粒的插入片断序列与基因文库登录的目的片段序列(GenBank：X52593)仅两个碱基位点不一致，无移码突变，核苷酸同源性为99.8％。 2、重组质粒转化EcoliBL21(DE3)plysS，经IPTG诱导后，与没有经过IPTG诱导的阴性对照相比，在38000处新增一明显条带，与理论相对分子质量一致。目的蛋白的表达量可达到菌体总蛋白的32％；Ni2+亲和层析纯化后，该位置可见一明显条带，且未见杂蛋白带。纯化的重组蛋白和重组质粒转化菌的提取液均能与包被有抗PBP2a特异性单克隆抗体的胶乳试剂产生凝集反应，而对照空载体转化菌的提取液则未见凝集出现。 3、获得的抗血清经ELISA方法检测抗体滴度达到了1∶25600，Westernblot分析显示该多克隆抗体与纯化的PBP2a转肽酶区蛋白、MRSA菌体蛋白提取液中天然的PBP2a蛋白均能发生抗原抗体结合反应，而与对照MSSA菌体蛋白提取液则未见抗原抗体结合反应，表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性。以纯化的抗体致敏胶乳建立了检测PBP2a的胶乳凝集试验，所制备的胶乳试剂特异性、敏感性、稳定性良好。 结论1、成功构建了编码MRSAPBP2a转肽酶区基因的原核表达载体并获得了重组蛋白的高效表达，制备了高纯度的目的蛋白。 2、成功制备了抗MRSAPBP2a转肽酶区的多克隆抗体，并初步建立了敏感性、特异性良好的检测PBP2a的乳胶凝集试验，为进一步制备单克隆抗体并建立更加敏感、特异的检测PBP2a的免疫学测定方法提供了借鉴。 第4页

目录

缩略语

前言

第一部分:MRSA PBP2a转肽酶区编码基因的克隆及序列测定

第二部分:MRSA PBP2a转肽酶区的表达及纯化

第三部分抗PBP2a转肽酶区多克隆抗体的制备及鉴定

第四部分胶乳凝集试验检测方法的建立

参考文献

附录1 表达载体pET-His的相关资料

附录2 重组质粒测序结果

PBP2a的分子生物学特性及其临床应用的研究进展

致谢（ACKNOWLEDGMENTS）

在校期间发表的论文