1.激素耐药型与激素敏感型肾病综合征差异表达基因分析;2.中国南方迟发激素耐药型肾病综合征患儿NPHS2基因变异研究

摘要

1.目的：原发性肾病综合征（PNS）是儿童最常见的肾小球疾病，根据患儿对激素治疗的疗效，可分成激素敏感型肾病综合征（SSNS）和激素耐药型肾病综合征（SRNS）两类。大部分PNS患儿对激素敏感，预后良好；约10％～20％的PNS患儿对激素耐药，其中大部分病程迁延，逐渐进展到终末期肾病（ESRD），因此深入研究PNS的耐药机制是提高SRNS诊疗水平的关键问题。由于SSNS和SRNS在临床表现和药物疗效的显著不同，可能在分子水平，即基因水平表达变化上存在着明显的差异。本研究从基因水平探讨SSNS和SRNS分子遗传学方面的差异，希望能初步探讨两种类型PNS相应的分子生物学标志，为SRNS的临床诊断治疗提供分子实验依据。 方法：分别选取SSNS、SRNS患儿及正常儿童各3例，收集其外周血单个核细胞，采用Trizol法提取总RNA，试剂盒纯化mRNA并逆转录合成生物素标记的cRNA探针与Affymetrix Human Genome U133 Plus2．0基因表达谱芯片杂交；GCOS软件分析各组基因显著差异表达情况；荧光定量PCR验证基因芯片筛选出的显著差异表达基因结果；层次聚类、Gene Ontology数据库和KEGG pathway数据库对差异表达显著的基因进行生物信息学分析。 结果： 1．基因表达谱总体变化：根据Affymetrix基因芯片数据筛选标准，2倍以上与肾病综合征相关的差异基因共157条；SRNS组与正常对照组相比较，差异表达基因87条，其中上调基因60条，下调基因27条；SSNS组与正常对照组相比较，差异表达基因44条，其中上调基因36条，下调基因8条； 2．荧光定量PCR验证基因芯片结果：经生物学信息学分析选择5个认为可能有意义的基因，其中VEGFC、CTNNB1在SRNS组中上调，CDGAP在SRNS、SSNS两组中均上调、CLNS1A在SRNS组下调而在SSNS组上调，HLA-DRB4在SSNS组下调。目的基因经荧光定量PCR检测与芯片结果变化趋势一致，表明了芯片结果的可重复性。 3．生物信息学分析：聚类分析显示SSNS组与对照组基因表达差异较小，SRNS组与SSNS组及对照组差异均明显；Gene Ontology数据库功能分析发现SRNS组差异基因主要参与细胞核内生物学活动和细胞信号转导；HLA-DRB4基因为人类白细胞抗原成分，在SSNS组中表达差异最为明显；CLNS1A基因在SRNS组下降，而在SSNS中显著表达上调，功能涉及细胞氯离子转运；KEGG pathway数据库分析发现认为CTNNB1基因可能是引起FSGS肾组织纤维化的多条作用通路的共同致病基因，尤其与TGF-β信号通路联系密切；wnt信号通路介导细胞增殖在SRNS患儿FSGS发生中的作用值得进一步研究。 结论：不同临床和病理类型PNS涉及多个差异基因和生物学途径，FSGS的SRNS患儿激素耐药与核内遗传的关系更为密切；HLA-DRB4和CLNS1A基因可能在不同类型PNS发病机制中发挥重要作用；CTNNB1基因在TGF-β信号通路和wnt信号通路中对FSGS发生可能起重要作用，基因芯片为SSNS和SRNS相关机制研究提供一系列重要线索。 2.目的：原发性肾病综合征（PNS）是常见的儿童肾脏疾病，以大量蛋白尿、低白蛋白血症、高脂血症和浮肿为主要临床特征。越来越多的研究证实NPHS2基因突变可导致原发性激素耐性型肾病综合征（SRNS）。部分激素敏感的患儿表现为迟发激素耐药（late SRNS），与原发性SRNS患儿存在相似的激素耐药表现，但其出现迟发耐药的机制目前尚不明确。本研究对中国南方迟发SRNS患儿进行NPHS2基因分析，以探讨NPHS2基因与迟发SRNS的临床特征和疾病易感性的关系。 方法：收集来自中国南方汉族的30例迟发SRNS患儿和20例正常儿童的病例资料（包括发病年龄、随访时间、发病至迟发耐药时间、迟发耐药前复发次数和治疗方案等临床数据）。采集受试者外周血，采用盐析法提取基因组DNA。采用PCR方法分别扩增NPHS2基因8个外显子及部分内含子，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，进行直接测序，使用DNAstar软件将所得结果与美国国立生物技术信息中心（NCBI）的基因数据库进行比对；比较两组受试者的等位基因频率及基因型频率，统计其分布差异是否有统计学意义。 结果： 1．所有受试者均未检测到NPHS2基因突变； 2．11例迟发SRNS患儿和4例正常对照组儿童存在单核甘酸多态性（SNP），均为已报道的SNP：288C>T的等位基因频率（C/T）分别为0．93、0．07；954T>C的等位基因频率（T/C）分别为0．80、0．20；1038A>G的等位基因频率（A/G）分别为0．90、0．10，两组间各SNP的基因频率和基因型差异无统计学意义； 3．携带SNP患儿与未携带SNP患儿其临床特征无显著性差异。同时携带3个SNP的3例患儿中2例肾组织活检为FSGS，但差异无统计学意义。 结论：中国南方地区汉族儿童NPHS2基因存在288C>T、954T>C和1038A>G3种SNP；迟发SRNS和正常对照组相比；基因变异可能不是中国南部儿童迟发激素耐药型肾病综合征发病的遗传学基础：尚不能认为3个SNPs的同时存在与迟发SRNS患儿肾组织病理类型相关；对迟发SRNS患儿早期联合应用细胞毒药物治疗可能有助于患儿尽快达到缓解；肾组织病理类型的转变可能与对激素敏感性的改变有关。

目录

论文说明:英文缩写

声明

第一部分 激素耐药型与激素敏感型肾病综合征差异表达基因分析

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述一 基因芯片技术在肾小球疾病中的应用

第二部分 中国南方迟发激素耐药型肾病综合征患儿NPHS2基因变异研究

前言

对象与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述二 儿童原发激素耐药型肾病综合征NPHS2基因研究进展

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