腺病毒介导NK4基因和B7-1基因共表达治疗胰腺癌的体外研究

摘要

胰腺癌是消化系统较为常见的恶性肿瘤。受胰腺解剖和胰腺癌生物学特征等因素的影响，胰腺癌早期诊断困难，确诊时大多已属晚期，外科手术是现阶段胰腺癌最为有效的治疗方式，但术后容易复发和转移。尽管近年来诊断和治疗技术已有较大改进，但胰腺癌的预后仍未有明显的改善，患者的5年生存率仍然小于5%。因此，寻找新的治疗方案以提高综合治疗效果是目前亟待解决的重要问题。 基因治疗为胰腺癌的治疗提供了新的希望，然而现已报道的大多数肿瘤临床基因治疗方案中，只有采用单一抗肿瘤的目的基因，而单基因治疗肿瘤疗效不甚理想，局限性大，相比之下，多基因联合治疗具有更大的合理性与优越性，是肿瘤基因治疗发展的必然方向。肿瘤发生及演进是涉及多基因的复杂过程，而单一抗肿瘤基因作用不强大且有限，往往难以有效抑制肿瘤细胞增殖。NK4是肝细胞生长因子（HGF）的拮抗剂及强有力的肿瘤血管生成抑制剂。B7-1为共刺激因子对诱导产生肿瘤特异性CTL具有十分重要的作用。因此，利用这两种基因联合治疗胰腺癌，可充分发挥抗肿瘤基因间相互协同作用，为进行胰腺癌的体内共表达基因治疗奠定基础。 目的：了解腺病毒感染SW1990的能力以及共表达的基因NK4-B7-1基因在靶细胞内的表达情况，并观察体外腺病毒感染及共表达基因NK4-B7-1基因对胰腺癌细胞生长是否有影响。 方法：1．将Ad-NK4-B7-1重组腺病毒载体感染HEK293包装细胞制备重组腺病毒载体，用绿色荧光蛋白测定病毒滴度；2．用不同MOI的上述腺病毒处理人胰腺癌SW1990细胞，24h后计数GFP阳性细胞百分率以测定腺病毒感染率；3．用重组Ad-NK4-B7-1腺病毒颗粒感染SW1990胰腺癌细胞，用荧光定量RT-PCR检测体外感染SW1990胰腺癌细胞中NK4基因和B7-1基因的mRNA水平，Western Blot检测B7-1蛋白的表达；4．MTT观察Ad-NK4-B7-1感染在体外对SW1990生长的影响，并检测NK4-B7-1重组腺病毒体的细胞克隆表达产物对血管内皮细胞生长的影响。 结果：该病毒能有效感染HEK293细胞并在细胞内成功增殖，通过不同MOI的Ad-GFP腺病毒感染，发现在MOI小于80 efu/ml时，感染效率随病毒滴度的增加而提高。当MOI为60 efu/ml时，SW1990细胞的感染效率接近100%。以病毒感染24小时NK4-B7-1基因表达水平为100%，B7-1及NK4都在第5天达到最高水平的表达，随后开始下降，第九天的表达水平只有24小时表达量的1．5倍左右。到12天时两个基因的表达水平都只剩下24小时表达量的约1/4。Western-blot法检测到Ad-NK4-B7-1感染能明显增强B7-1的表达；Ad-NK4-B7-1感染对SW1990的生长无明显改变．病毒感染上清液可显著抑HGF诱导的血管内皮细胞的生长。 结论： 1．腺病毒介导能有效地感染SW1990细胞并表达高水平的NK4和B7-1基因； 2．腺病毒感染及Ad-NK4-B7-1的表达在体外对SW1990生长无明显影响； 3．Ad-NK4-B7-1能够抑制血管内皮细胞的生长，提示其在肿瘤基因治疗中可能具有重要意义。这些研究为进一步研究B7-1和NK4基因联合治疗胰腺癌动物实验提供了依据。

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结 果

讨论

结论

参考文献

综述 肝细胞生长因子及其拮抗剂NK4在肿瘤作用的研究进展

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