蛋白质组学技术分析妊娠期高血压孕妇尿液分子标记物的研究

摘要

一、研究背景:
　　1.妊娠期高血压
　　妊娠期高血压(Gestational hypertension)是妊娠期高血压疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy)的一种,是妊娠期特有的以血压升高为主要临床特征的一种疾病,单纯而严重的妊娠期高血压孕妇,虽无蛋白尿,母儿患病率较高,甚至高于轻度子痫前期患者[1]。临床上约25％～50%最开始诊断为妊娠期高血压者,可以进展为子痫前期-子痫,并且妊娠期高血压的发病越早,其进展为子痫前期-子痫的可能性越大,可导致孕产妇脑血管意外、子痫、围产儿早产、甚至死亡等不良妊娠结局,其对孕产妇及围产儿造成的危害日益受到人们的认识和关注;在我国,妊娠期高血压疾病是导致孕产妇及新生儿死亡的主要原因之一,严重危害母婴健康[2]。近年来,国内外学者通过免疫、基因等方面的研究,对妊娠期高血压疾病的某些发病因素有所了解,但其发病机理仍未全面阐明,也缺乏有效、全面的特异性检测指标和方法,用于预防、早期筛查该疾病,以及预测其严重程度[3,4]。因此寻求妊娠期高血压疾病特异性的分子标记物,进一步阐明其发病机制,实现早期诊断及预测妊娠期高血压疾病是近年来产科研究的热点。
　　2.蛋白质组学研究方法
　　蛋白质组学是以一个细胞、组织或体液中,全部表达的蛋白质为研究对象;是当前生命科学研究中的前沿领域,是实现机体蛋白质的全面、快速、准确的鉴定研究中必不可少的关键性技术之一。机体内细胞或组织等内的蛋白质组细微的变化,就可以引起机体内某些重要通路的抑制或激活,进而可能导致细胞的变异或者分裂,蛋白质组作为机体一个高度动态的系统,蛋白质丰度的变化,是许多诸如心血管疾病、癌症等疾病发病过程中的重要标志,研究病变细胞相对于机体正常细胞中蛋白质表达丰度的变化,发现疾病相关的生物标志物对实现疾病的早期诊断及早期预测,具有十分重要的意义[5]。应用蛋白质组学在临床方面,可以研究特异蛋白质与疾病的关系,从而找到疾病的标记蛋白,为临床提供新的诊断依据[6]。蛋白质组学的特点是采用高通量的蛋白质鉴定技术,结合高分辨率的蛋白质分离技术,全面地研究在生理及病理等各种特定情况下,机体动态表达的全部蛋白质的整体变化。
　　3.蛋白质组学在临床中的应用
　　蛋白质组学技术的应用,在临床领域中还仅仅局限于筛选疾病相关的特异性标志物。蛋白质组学研究中应用最多是在肿瘤相关方面,蛋白质组学不仅为其提供了一个新的方法以研究肿瘤的发病机制,而且利用蛋白质质谱可以进行肿瘤的早期诊断及判断患者的预后,判断有些特异体质的患者治疗后的机体反应,用于判断机体的耐药性。另外,蛋白质组学也较多的应用于新药开发中。通过比较正常细胞与疾病细胞中的蛋白质组,寻找一些疾病相关的蛋白质,并将这些蛋白质作为疾病诊断的的关键点。国内研究学者[7]应用蛋白质组学方法,分析正常4例人尿液蛋白质组成成分,初步建立了正常人尿液的蛋白质图谱,为分析病理情况下尿液蛋白质成分的改变提供了基础资料,为今后研究病理情况与生理情况下尿液蛋白质组的差异提供依据。俞丽丽等[8]运用蛋白质组学的方法,建立了妊娠期高血压疾病与正常妊娠孕妇的血清蛋白质谱图,进一步比较两组,发现二者之间存在差异的5个质荷比相对应蛋白质,这5个质荷比相对应的蛋白质有可能成为早期筛查妊娠期高血压疾病的血清学标志物。国外研究者[9]利用蛋白质组学技术建立了检测早期卵巢癌的血清蛋白质图谱;国外学者[10]筛选了葡萄胎组织的蛋白质图谱,发现3种金属结合多肽的表达量明显少于对照组。研究也发现[11]在胎膜早破患者血清蛋白质图谱中,发现了两种未知功能的蛋白质,认为这两种未知蛋白质可能是胎膜早破诊断的特异性生物标志物。
　　4.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
　　在蛋白质组学研究中,生物质谱已成为蛋白组大规模分析的强有力工具,是近年来新兴的一种技术,应用日益广泛。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是近年来发展起来的,新型的软电离生物质谱的一种,主要由基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)及飞行时间质量分析器(TOF)两部分组成。MALDI-TOF-MS具有特异度高、灵敏度高及分辨率高等特点。国内外众多研究者,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术,发现了许多对疾病诊断、治疗以及预后有重要作用的疾病标志物[12-15]。为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段,扮演着越来越重要的作用。
　　5.尿液蛋白质组学的优势
　　临床上尿液与羊水、胎盘等其他体液样本相比,蛋白组成相对简单、易于分析,且尿液获得相对无创、收集便利,并能在一定程度上,反映血液和整个机体的状态,同时尿液的复杂度低于血液等样品,更容易观察其中的低丰度蛋白的变化,有利于疾病标志物的检出[16],是疾病重要的标志物来源。“尿蛋白质组学”(urinaryProteomic)运用高通量的蛋白质组学技术,实现了尿液蛋白质全面的、准确及快速的分析,鉴定出差异蛋白;研究尿液蛋白质成分的改变,还可用于解释生理学代谢、毒理及许多疾病的进展过程,有助于阐明疾病的发病机制、寻找早期诊断的生物学标记物。鉴于尿液蛋白质组学的以上优点,国内外学者目前热衷于对生理和疾病状态下的尿液进行蛋白质组学分析,获得了正常人尿液的标准蛋白图谱[17,18]、并研究机体尿液蛋白在不同疾病状态下的整体变化[19-21]。
　　应用蛋白质组学在临床方面可以研究特定蛋白与疾病的关系,从而找到疾病标记蛋白,为临床提供新的诊断依据。蛋白质组学方法中基质辅助激光解吸离子化-飞行时间/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)具有灵敏度高、特异度高等优越性。临床上尿液与血清等其他体液样本相比,其获取无创、收集便利,蛋白组成分相对简单、易于分析。国内外学者也做了大量尿液蛋白质组学研究[22-24],技术相对成熟。在此研究背景下,本实验采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)技术,对妊娠期高血压孕妇和正常孕妇尿液蛋白质进行对比分析。
　　二、研究目的:
　　旨在筛选妊娠期高血压孕妇尿液中的特异性生物标志物,建立正常孕妇及妊娠期高血压孕妇尿液蛋白质指纹图谱模型,并探讨其意义。如果在早孕期间,这些蛋白质有表达并能够检测出来,则有利于妊娠期高血压高危人群的早期筛查,为早期筛查妊娠期高血压提供思路和方法。如果进一步研究这些蛋白质的功能,有可能阐明妊娠期高血压的发病机理。初步探讨这些差异蛋白是否可以作为妊娠期高血压的生物标志物,甚至是妊娠期高血压疾病的诊断标志物,寻找与妊娠期高血压疾病诊断相关的疾病标志物,以后将其运用于早期诊断妊娠期高血压疾病。
　　三、材料与方法:
　　1.妊娠期高血压与正常妊娠孕妇尿液蛋白质组分析
　　1.1、实验分组
　　选择2011年9～12月在南方医科大学附属深圳妇幼保健院住院的孕晚期孕妇共20例。正常健康足月妊娠孕妇10例,妊娠期高血压组10例,妊娠期高血压诊断参考第7版《妇产科学》,(妊娠期高血压诊断标准:妊娠期首次出现BP≥140/90mmHg,并于产后12周恢复正常,尿蛋白(-),少数患者可伴上腹不适或血小板减少,产后方可确诊),入选对象均排除其他妊娠合并症及并发症。各组孕妇之间年龄、孕周、孕产次均无统计学差异。
　　1.2、实验方法
　　尿液样品经浓缩、蛋白纯化后蛋白定量分析,建立荧光差异凝胶双向电泳(DIGE)图谱;DeCyderV6.5分析软件筛选差异蛋白质;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)质谱仪进行肽指纹图谱鉴定,通过Mascot软件进行数据库搜索,得到蛋白质鉴定结果。
　　2.激肽原1在妊娠期高血压疾病孕妇尿液中的表达
　　2.1、实验分组
　　选择2012年2～6月在南方医科大学附属深圳妇幼保健院住院的妊娠期高血压疾病组60例(妊娠期高血压组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组孕妇各20例)及正常妊娠对照组尿液20例,入选对象均排除其他妊娠合并症及并发症。各组孕妇之间年龄、孕周、孕产次均无统计学差异。
　　2.2、实验方法
　　蛋白质组学结果中的差异蛋白激肽原1,用酶联免疫吸附试验测定妊娠期高血压疾病各组与正常妊娠组尿液中激肽原1含量。采用SPSS13.0统计软件包进行处理:数据用均数±标准差(x±S)表示,P<0.05差异具有统计学意义。
　　四、结果:
　　1.妊娠期高血压与正常妊娠孕妇尿液蛋白质组分析
　　利用Image Master 2D Platinum 6.0软件进行点检测、图像的强度校正、匹配等分析,根据国际标准,以1.5倍为标准,妊娠期高血压与正常妊娠组相比(G/N),共检测出45个差异点;对45个差异蛋白点进行酶解、MALDI-TOF/TOF分析,通过Mascot软件检索SwissProt数据库鉴定蛋白,妊娠期高血压和正常对照组的尿液总蛋白含量相比(G/N),去除未鉴定出来和鉴定结果相同的蛋白,共鉴定出22种蛋白质,其中上调的蛋白有L-型前列腺素D合成酶等14种,下调的有激肽原1等8种;蛋白评分为100%,鉴定结果高度可信。
　　2.激肽原1在妊娠期高血压疾病孕妇尿液中的表达
　　激肽原1酶联免疫吸附试验结果证实,妊娠期高血压疾病各组较正常妊娠组尿液中激肽原1含量下降,P<0.05,差异均具有统计学意义。
　　五、结论:
　　应用蛋白质组学技术成功筛选出妊娠期高血压孕妇与正常孕妇尿液中存在激肽原1等22种差异蛋白,并运用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)验证了妊娠期高血压疾病(妊娠期高血压、轻度子痫前期、重度子痫前期)及正常妊娠对照组孕妇尿液中激肽原1含量,其中妊娠期高血压组与正常妊娠组结果与蛋白质组学结果一致,蛋白质组学结果中的这些差异蛋白可能是妊娠期高血压甚至是妊娠期高血压疾病诊断的相关标志物,蛋白质组学为研究妊娠期高血压疾病孕妇尿液检测的特异标志物提供了基础资料。

目录

封面

目录

中文摘要

1.1 实验分组

1.2 实验方法

2.1 实验分组

2.2 实验方法

英文摘要

前言

第一章 妊娠期高血压与正常妊娠孕妇尿液蛋白质组分析

1.实验材料

1.1 主要仪器设备

1.2 主要试剂

1.3 主要试剂的配制

1.4 主要数据库及生物信息学网站

2.实验方法

2.1 尿液样品前期浓缩处理

2.2 尿液总蛋白的纯化

2.3 蛋白定量

2.4 CyDye染料标记

2.5 双向凝胶电泳

2.6 分析胶的成像

2.7 制备胶的制作

2.8 制备胶的胶体考马斯亮蓝染色以及扫描

2.9 差异点的软件分析及挖胶

2.10 考染胶粒的胶内酶解

2.11 样品蛋白的纯化浓缩及点靶

2.12 质谱鉴定

3.结果

3.1 蛋白质定量结果

3.2 分析胶荧光图像扫描

3.3 制备胶图像扫描

3.4 蛋白差异点分析

3.5 差异蛋白点质谱分析

第二章 激肽原1在妊娠期高血压疾病孕妇尿液中的表达

1.实验材料

1.1 材料来源及实验分组

1.2 主要实验试剂和耗材

2.实验方法

2.1 实验原理

2.2 实验步骤

3.数据处理

4.结果

第三章 讨 论

1.妊娠期高血压疾病预测相关研究

2.尿液蛋白质组学与疾病诊断

3.激肽原1与妊娠期高血压疾病

4.本研究不足之处

第四章 结 论

参考文献

综述

硕士研究生期间发表的论文及取得的成果

致谢

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