利用牛肠道Faecalibacterium菌的16S rDNA基因对水体牛粪便污染源的检测方法研究

摘要

随着养殖业的发展，动物粪便污染日趋严重，已经严重影响水体安全，为了了解水体污染情况，就需要一种对于粪便污染源的快速准确的检测技术和方法。但是传统的粪便指示菌，譬如大肠杆菌、肠球菌等，由于其被排放到水体后能够继续繁育增殖，难以真正实时反映水体粪便污染的情况。 本课题中选取Faecalibacterium 菌作为粪便指示菌，根据Faecalibacterium 菌16S rDNA基因序列在不同宿主会表现出序列差异来寻找牛物种的特异性标记物，这种技术能保证粪便污染源检测的准确性。 实验中采集了324份鸡、鸭、狗、人、猪、牛（粪便污染最为严重的几种物种）粪便样品，利用高通量测序手段获得个体粪便里微生物16S rDNA基因序列。经高通量测序平台共测取564,224条可用的16S rDNA基因序列。经过数据分析得出，六个物种粪便样品中，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门是三大优势菌门种，厚壁菌门在不同动物中比例约占 39.01%—69.44%，拟杆菌门约占12.43%—47.41%，变形菌门约占0.79%—38.82%。鸡、鸭、狗、人、猪、牛粪便样品里微生物Shannon-Wiener平均指数依次是1.20、1.23、1.16、0.87、0.94、1.30， Simpson平均指数依次是0.65、0.64、0.64、0.59、0.46、0.66，Pielou平均指数依次是0.40、0.37、0.40、0.42、0.35、0.44。在牛这个物种间，黄牛的丰富度指数（1.30、0.67）与均匀度度指数（0.45）与水牛丰富度指数（1.31、0.69）与均匀度度指数（0.45）很接近，且三项指标都高于奶牛丰富度指数（1.23、0.48）与均匀度度指数（0.43）。结果表明：水牛、黄牛肠道微生物基因组DNA浓度略高于奶牛，可能是水牛、黄牛、奶牛的饮食结构不同、生活环境的差异性等因素在一定程度上影响了肠道内微生物的分布。 通过比较各物种16S rDNA基因序列的差异，找出牛的特异性基因标记物，设计对应的引物，并利用定量PCR技术和普通PCR技术结合来验证引物的各项指标。确定两组特异性引物(CFY-1与CFY-2)，都只能扩增出牛粪便中的目的片段，CFY-1扩增的目的片段大小为176bp，CFY-2扩增的目的片段大小是209bp，与其他物种粪便无阳性反应，特异性为100%；其中CFY-2的阳性率93.75%（45/48）稍高于CFY-1阳性率89.58%（43/48），CFY-2的最低检测限（2.49×108拷贝/100ml）略低于CFY-1（7.06×108拷贝/100ml），因此CFY-2的灵敏度更高；另外，通过采取实际牛粪便污染水样来检测CFY-1与CFY-2的实用性，发现两者均可有效的追踪出污染源，只是CFY-2较CFY-1的效果更明显（检测出的粪便污染源点更多）；综上，确定CFY-2是牛粪便基因最佳标记引物。 为了探究CFY-2特异性基因标记物在水环境中的稳定性，采用实验室模拟牛粪便污染水体，探究标记物在不同温度（10℃与30℃）、水体（蒸馏水与河水）、光照（日照24h；日照14h；日照10h；黑暗24h）中的稳定性。结果显示基因标记物在蒸馏水中10℃与30℃的情况下，能被检测到时间分别为80h、48h，在河水中10℃与30℃的情况下，能被检测的时间分别为66h、30h；基因标记物在日照24h、日照14h黑暗10h、日照10h黑暗14h、黑暗24h的条件下，能被检测时间依次为31h、37h、42h、54h。 本文为水环境中的粪便污染源检测提供了一种高效精确的检测方法，探究结果证实利用Faecalibacterium 16S rDNA基因标记检测能独立检测水环境粪便污染源与污染程度；亦可作为一种辅助检测技术，补充传统粪便污染指示菌的缺陷，使检测结果更有说服力。

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摘 要

ABSTRACT

目 录

1 绪 论

1.1 粪便污染

1.2 牛粪便污染

1.2.1 牛粪对空气的污染

1.2.2 牛粪占用土地与对土壤的污染

1.2.3 牛粪对环境水的污染

1.3 牛粪便污染特征

1.4 牛粪便污染的解决途径

1.5 水体中粪便污染源的检测方法

1.5.1 MST的指示物选择

1.5.2 MST的源指示物检测方法

1.5.3 MST的源解析方法

1.6 检测水体粪便污染的新型指示菌

1.7 粪便指示菌在水体中的稳定性研究

1.8 研究目的、内容及技术路线

1.9研究创新点

2 实验材料和方法

2.1实验耗材

2.1.1 采集粪便样品

2.1.2采集污水样品

2.1.3 实验试剂与耗材

2.1.4 主要试剂盒

2.1.5 主要仪器设备

2.1.6 实验主要溶液及配制方法

2.2 实验方法和步骤

2.2.1提取粪便样品基因组DNA

2.2.2 粪便基因组DNA的验证

2.2.3 高通量测序（454焦磷酸测序）

2.2.4高通量数据分析

2.2.5 各物种间和牛粪便样品间的微生物多样性分析

2.2.6 探究基因标记物特异性

2.2.7 测定基因标记物阳性率

2.2.8 确定基因标记物灵敏度

2.2.9 基因标记物的实用性验证

2.2.10选择最适牛粪便基因标记物

2.2.11 基因标记物稳定性及衰减规律的研究

3 实验结果与分析

3.1基因组DNA的数据结果

3.1.1 基因组DNA的数据结果分析

3.2.1 高通量测序结果

3.2.2 不同物种肠道微生物多样性的结果

3.2.3 不同物种肠道微生物多样性结果分析

3.2.4 不同牛粪便样品的微生物多样性结果

3.2.5 不同牛粪便样品的微生物多样性结果分析

3.2.6 Faecalibacterium菌在各物种的比例结果

3.3 基因标记物的确定

3.3.1 初步选择基因标记物引物

3.4.1特异性结果

3.4.2特异性结果分析

3.4.3阳性率结果

3.4.4阳性率结果分析

3.5.1 重组质粒的测序检测

3.5.2 连接转化实验讨论

3.5.3灵敏度结果

3.5.4灵敏度结果分析

3.5.5实用性结果

3.5.6实用性结果分析

3.5.7 确定最适牛粪便基因标记物

3.6 基因标记物稳定性探究结果

3.6.1 水环境和温度对基因标记物稳定性的影响

3.6.2 光照时间对基因标记物稳定性的影响

3.6.3 基因标记物稳定性探究结果分析

4 结论与展望

4.1 总结

4.2 讨论

4.3 后续探究工作展望

致 谢

参考文献