杀菌剂抑霉唑免疫分析技术的研究

摘要

随着农业的发展，农药在农业生产中的使用越来越广泛，但在带来经济效益的同时也给人类和环境带来了一定的危害。抑霉唑是一种内吸性苯并咪唑类杀菌剂，现已广泛用于果蔬的防腐保鲜，但由于过量或不合理的使用，使其在农副产品中存在一定的残留从而影响人们的健康。因此为了确保消费者的健康，应该加强对农副产品中抑霉唑的监控。
　　 目前用于检测抑霉唑残留的多为仪器分析法，这些方法由于前处理复杂、设备昂贵且需要熟练的技术人员，难以实现大量样品快速、现场筛选的需要。因此，建立快速、有效检测抑霉唑残留的方法十分必要。本实验建立了酶联免疫分析法(ELISA)和电化学免疫分析法两种免疫分析技术对柑橘中的抑霉唑残留进行检测，方法简单、快速、灵敏高且检测成本低，因此具有一定的实际意义。
　　 实验以抑霉唑的降解物咪唑乙醇为原料制备得到半抗原，并与载体蛋白偶联合成人工抗原。通过动物免疫实验制备了抑霉唑的多克隆抗体，并进一步研制成能对柑橘中抑霉唑残留进行快速筛选的试剂盒；同时利用所制备的多克隆抗体研制了测定柑橘中抑霉唑残留的电化学免疫传感器。具体研究内容及结果如下：
　　 1、以咪唑乙醇为原料通过亲和取代反应得到抑霉唑的半抗原，产物经薄层层析(TLC)和核磁共振(1H-NMR)鉴定成功后，采用活化酯法分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联得到免疫原(HIA-BSA)和包被原(HIA-OVA)，经紫外光谱分析法鉴定并计算其偶联摩尔比分别为13∶1和7∶1，符合小分子免疫的要求，通过免疫动物获得了效价高达6.4×104倍的多克隆抗体。
　　 2、通过优化影响ELISA方法的因素，如包被介质、反应时间、有机溶剂的浓度、封闭介质等，确定ELISA法的最佳条件为：以0.01 mol/L、pH=9.6的CBS为包被缓冲液在4℃下包被12 h，用2％的明胶封闭2 h，TMB作为底物并作用15 min，甲醇含量为10％的pH7.4，0.01 mol/L的PBS作为样品的稀释液。用间接非竞争ELISA法确定抗原抗体的最佳工作浓度为：抗原稀释浓度为5μg.mL-1，抗体的稀释倍数为32000。根据优化后的条件建立间接竞争ELISA法对抗体的亲和性与特异性鉴定。结果表明所制备的抗体对抑霉唑有较高的亲和力，所建立的标准曲线在0.01μg.mL-1～50μg.mL-1浓度范围内抑制率与抑霉唑浓度的对数有较好的线性关系，其回归方程为y=0.1653x+0.4596，R2=0.9972，IC50为1.75μg.mL-1。同时，对抑霉唑结构类似物进行交叉反应，结果除咪唑乙醇外交叉率均小于2％，说明抗体对抑霉唑有较高的特异性。
　　 3、用制备得到的多克隆抗体研制了间接竞争ELISA试剂盒用于检测柑橘中的抑霉唑残留。通过ELISA法与GC分析法对比，结果ELISA检测的平均回收率为96.99％，GC检测的平均回收率为97.73％，两者的检测的相符率为99.24％，ELISA法的最低检测限为0.0136μg.mL-1。同时对试剂盒的精密度、准确度和灵敏度进行评价，结果样品的添加平均回收率为97.38％，板间的变异系数为6.18％～6.87％，板内的变异系数为3.42％～4.02％，检测灵敏度为0.0136μg.mL-1，可满足柑橘样品中抑霉唑残留的检测要求。制备的试剂盒能在4℃下保存6个月，37℃下保存15天，且可反复冻融2次。
　　 4、利用自组装技术将三巯基丙酸固定在裸金电极上形成单分子膜，以1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀亚胺(NHS)作为活化剂，将抑霉唑多克隆抗体以共价键形式固定在经三巯基丙酸修饰的金电极上，制备了一种检测柑橘中抑霉唑残留的电化学免疫传感器。根据传感器基于抗原抗体反应的原理对抑霉唑进行定量测定，该传感器的检测范围为0.01～5μg.mL-1，检测限为0.162μg.mL-1。同时对传感器的再生性和保存期进行考察，结果表明用pH=2.2的甘氨酸-HCl缓冲溶液最多可使传感器再生5次，传感器可在4℃下保存2个月。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章 文献综述

1.1抑霉唑的研究进展

1.1.1结构与性质

1.1.2作用机理及毒性

1.1.3应用现状及限量标准

1.2杀菌剂残留检测技术的研究现状

1.2.1仪器分析技术

1.2.2免疫分析技术

1.3电化学免疫传感器

1.3.1电化学免疫传感器的原理和分类

1.3.2电化学免疫传感器在农药残留中的应用

第二章 引言

第三章 抑霉唑多克隆抗体的制备与鉴定

3.1材料与仪器

3.1.1试验试剂

3.1.2试验仪器

3.2试验方法

3.2.1半抗原(Imazalil haptcn，HIA)的合成与鉴定

3.2.2人工抗原的合成与鉴定

3.2.3多克隆抗体的制备与鉴定

3.3结果与分析

3.3.1半抗原的鉴定

3.3.2人工抗原的鉴定

3.3.3多克隆抗体的鉴定

3.4小结与讨论

第四章 抑霉唑酶联免疫分析方法(ELISA)的建立及试剂盒的研制

4.1材料与仪器

4.2试验方法

4.2.1酶联免疫分析方法的建立

4.2.2试剂盒的设计

4.2.3样品添加回收率试验

4.2.4试剂盒的评价

4.2.5保存期试验

4.3结果与分析

4.3.1酶联免疫分析方法的建立

4.3.2试剂盒的组成

4.3.3样品添加回收试验

4.3.4试剂盒的评价

4.3.5保存期试验

4.4小结与讨论

第五章 抑霉唑电化学免疫传感器的初步研制

5.1材料与仪器

5.2试验方法

5.2.1传感元件的修饰

5.2.2修饰电极的电化学表征

5.2.3免疫传感器对抗原的电位响应及检测限的确定

5.2.4传感器的再生

5.2.5免疫传感器的重现性和稳定性测定

5.3结果与分析

5.3.1对金电极固定过程的电化学表征

5.3.2免疫传感器对抗原的响应及检测限的确定

5.3.3传感器的再生

5.3.4免疫传感器的重现性和稳定性测定

5.4小结与讨论

第六章 结论与展望

6.1主要结论

6.2展望

附 录

参考文献

致 谢

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