三倍体枇杷实生后代及杂交后代SCoT标记及DNA甲基化分析

摘要

三倍体植物营养生长旺盛,具有明显的杂种优势。由于三倍体细胞体积的增大所引起的巨大性以及由于减数分裂紊乱而造成的育性降低,从而使三倍体成为获得无籽果实和获取材积为目标的果树与林木育种的主要目标,三倍体杂交或自交是获得非整倍体材料的有效途径。本试验目标起始密码子多态性分子标记(Startcondon targeted polymorphism,SCoT)和甲基化敏感扩增多态性(Methylationsensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,对天然三倍体枇杷优系‘H324’及其实生后代、大五星(2X)与天然三倍体枇杷优系‘G320’的杂交后代的DAN甲基化水平与模式的差异以及遗传多样性进行分析。为三倍体枇杷的遗传育种工作提供理论依据。试验主要结果如下:
　　 利用SCoT标记及形态学性状对天然三倍体枇杷优系‘H324’实生后代进行遗传多样性分析。形态学性状的平均变异系数为32.63％(16.20％～44.80％),多样性指数平均为1.92(1.47～2.24),根据形态学性状将12株实生后代分为3类。8条SCoT引物共扩增出71条扩增带,其中有42条呈多态性,多态性带比率为59.2％。12株实生后代遗传相似系数在0.84～0.97之间,在相似性系数0.902处,13份供试材料(含母本)可分成7类。6对MSAP引物组合对‘H324’及其实生后代共扩增出5227条带,其中甲基化位点766个,全甲基化位点544个,半甲基化位点222个,总甲基化率为14.7％。总甲基化率在7.4％-19.9％,全甲基化水平在3.7％-13％,半甲基化率在1.7％-7.9％。
　　 对9份大五星(2X)与天然三倍体枇杷优系‘G320’的杂交后代的6个主要形态性状进行统计并分析,结果显示,三倍体枇杷杂交后代主要性状有明显差异,表现出显著的形态多样性各性状变异系数平均为31.94％(17.81％～40.48％),多样性指数在平均为1.91(1.64～2.18),根据形态学性状将9株杂交后代分为2类,8条SCoT引物共产生68条扩增带,平均每条引物产生7～14条扩增带,其中有49条呈多态性,平均每条引物扩增出6.13条多态性带,多态性带比率为72.1％。根据SCoT标记数据11株枇杷(含亲本)相似性系数在0.74～0.95之间,在相似性系数0.85处可将供试材料分成了4个类群。4对MSAP引物组合对杂交后代及其亲本共扩增出2027条带,其中甲基化位点344个,全甲基化位点265个,半甲基化位点79个,总甲基化率为14.7％。杂交后代的总甲基化水平在13.4％-20.6％,全甲基化水平在10.2％-15.6％,半甲基化水平在2.1％-6.7％。
　　 综合本文研究结果,认为基于形态学性状和分子标记的两类聚类方法得出的结果无明显相关性。三倍体枇杷在杂交和自交中发生了一定程度的基因组DNA序列变异和甲基化水平与遗传模式的改变。研究表明这些天然三倍体枇杷后代出现了较大的遗传变异,具有较丰富的遗传多样性,具有作为枇杷遗传育种材料的潜在价值。

目录

文摘

英文文摘

第1章 文献综述

1.1 植物非整倍体研究进展

1.1.1 非整倍体的分类

1.1.3 缺体

1.1.2 非整倍体的应用

1.2 SCoT分子标记

1.2.1 SCoT标记原理

1.2.2 SCoT标记引物设计

1.2.3 SCoT标记优势及应用

1.3 DNA甲基化研究进展

1.3.1 DNA甲基化的生物学意义

1.3.2 DNA甲基化的发生机制

1.3.3 DNA甲基化调节植物正常生长发育

1.3.4 DNA甲基化与杂种优势

1.3.5 MSAP技术的原理及应用

1.4 三倍体枇杷研究进展

第2章 引言

第3章 材料与方法

3.1 试验材料

3.2 形态学数据统计

3.3 枇杷基因组DNA提取

3.4 SCoT子标记分析

3.4.1 SCoT-PCR反应体系

3.4.2 SCoT-PCR反应程序

3.4.3 引物筛选

3.4.4 SCoT-PCR产物检测

3.5 甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析

3.5.1 MSAP步骤

3.5.2 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

3.6 数据统计及结果分析方法

3.6.1 形态学数据分析

3.6.2 SCoT分子标记数据分析

3.6.3 MSAP分析

3.7 主要试剂配制

第4章 结果与分析

4.1 天然三倍体枇杷优系‘H324’实生后代SCoT分子标记及形态学分析

4.1.1 ‘H324’实生后代的形态学性状比较分析

4.1.2 天然三倍体枇杷优系‘H324’及其实生后代SCoT分子标记分析

4.2 天然三倍体枇杷优系‘H324’及其实生后代基因组DNA甲基化分析

4.2.1 ‘H324’及其实生后代母本基因组DNA的酶切、连接和预扩增

4.2.2 ‘H324’及其实生后代基因组DNA甲基化水平分析

4.2.3 ‘H324’及其实生后代基因组DNA甲基化模式分析

4.3 大五星(2x)与天然三倍体枇杷优系‘G320’杂交后代SCoT分子标记及形态学分析

4.3.1 杂交后代形态学性状分析

4.3.2 杂交后代及其亲本SCoT分子标记分析

4.4 大五星(2x)与天然三倍体枇杷优系‘G320’杂交后代基因组DNA甲基化分析

4.4.1 杂交后代及其亲本基因组DNA的酶切、连接和预扩增

4.4.2 杂交后代及其亲本基因组DNA甲基化水平分析

4.4.3 杂交后代及其亲本基因组甲基化模式分析

5.讨论

5.1 ‘H324’实生后代ScoT分子标记及形态学分析

5.2 大五星(2x)与天然三倍体‘G320’杂交后代ScoT分子标记及形态学分析

5.3 实生后代及杂交后代DNA甲基化模式和水平的遗传和变异

6.结论

参考文献

在读期间发表论文

致谢