黄连提取物诱导MCF-1乳腺癌细胞IFN-β和TNF-α表达有效部位的初步研究

摘要

目的：
　　 乳腺癌是一种严重危害女性身心健康的最常见恶性肿瘤，据统计，全球每年约有120万妇女患乳腺癌，在西方国家与地区其发病率和死亡率均居女性恶性肿瘤之首。最近有报道称，黄连可以诱导乳腺癌细胞表达IFN-β和TNF-α，并抑制癌细胞的增殖，促进癌细胞凋亡。IFN-β临床上主要用于抗病毒治疗，并可与TNF-α协同作用促进肿瘤细胞的凋亡。但是对于黄连中引起细胞凋亡作用的具体成分还不能确定。因此，在前期实验的基础上，本实验通过大孔树脂分离黄连提取物，初步研究黄连提取物中诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡，并能诱导IFN-β和TNF-α在MCF-7细胞中有效表达的部位。为进一步开发抗乳腺癌药物打下基础。
　　 方法：
　　 用不同浓度梯度乙醇做流动相，采用大孔树脂分离黄连提取物并运用薄层色谱进一步鉴定组份；Hoechst33258染色后荧光显微镜观察肿瘤细胞形态学的变化；流式细胞仪检测黄连提取物各层析组份作用MCF-7后细胞周期的变化；MTT法检测各组份对细胞生长的抑制作用；real-time PCR检测各组分处理细胞后IFN-β和TNF-αmRNA的表达。
　　 结果：
　　 1.经大孔树脂分离得到了四种组份A、B、C、和D，并经薄层层析初步鉴定，含小檗碱、巴马汀在内的生物碱成分，可能在组份B(35％乙醇层析组份)或组份C(70％乙醇层析组份)中，绿原酸等可能在组份B中。
　　 2.对层析组份A、B、C、D在24h、48h、72h三个时间点进行MTT检测结果显示：组份B的IC50值最低，因此组份B对乳腺癌细胞的抑制作用最强，层析组份A、B、C、D作用细胞24h的IC50值分别为：91.75μg/ml、36.5μg/ml、77.53μg/ml、75.51μg/ml；作用48h的IC50值分别为：51.19μg/ml、4.65μg/ml、36.78μg/ml、53.27μg/ml。作用72h的IC50值分别为：28.6μg/ml、3.65μg/ml、8.66μg/ml、32.45μg/ml。
　　 3.经大孔树脂分离得到的组份B在10μg/ml时可诱导细胞发生凋亡，荧光显微镜下观察其形态，可看到较明显的凋亡形态学变化，胞体缩小、胞浆浓缩、核染色质聚集、核固缩。而组份A、组份C和组份D处理的细胞和对照组细胞相比无明显变化。
　　 4.流式细胞仪检测，黄连提取物层析组份B作用癌细胞后，细胞被阻滞于G1/G0期，细胞DNA合成被抑制。
　　 5.real-time PCR结果显示，黄连提取物可以促进乳腺癌细胞MCF-7有效表达IFN-β和TNF-α，效果明显。在浓度范围2μg/ml～8μg/ml里，组份B均促进乳腺癌细胞表达IFN-β，并且组份B4μg/ml处理时对细胞表达IFN-β的诱导作用最大。而组份A、组份C、组份D不同浓度处理时对细胞表达IFN-β的影响不同：组份A(2μg/ml和4μg/ml)、组份C(2μg/ml和4μg/ml)、组份D(8μg/ml)处理时促进细胞表达IFN-β；组份A(8μg/ml)、组份C(4μg/ml和8μg/ml)、组份D(2μg/ml)处理时抑制细胞表达IFN-β。在浓度范围2μg/ml～8μg/ml里，各层析组份均促进乳腺癌细胞表达TNF-α；组份A2μg/ml处理组和组份C8μg/ml处理组的细胞TNF-α表达水平与对照组相比差异有显著性(P<0.05)，组份A(4μg/ml)处理组及组份B(2μg/ml和4μg/ml)处理组的细胞TNF-α表达水平与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)。
　　 结论：
　　 经大孔树脂分离得到的组份B能显著抑制乳腺癌细胞MCF-7生长增殖，并诱导细胞发生凋亡，而且能够阻滞细胞于G1/G0期，而其它组份没有这种作用。另外，组份B能诱导该肿瘤细胞表达IFN-β和TNF-α，推测这种诱导作用与其促发肿瘤细胞凋亡有关，具体的凋亡机制还需进一步研究。