橙汁中酵母菌的分离鉴定及其快速分子检测技术研究

摘要

橙汁是最重要的柑橘加工品，其国际贸易额已占柑橘贸易总额的1/3以上。我国的柑橘种植面积和产量均居世界第一，但橙汁产量只占世界总产量的1％左右。为满足快速增加的橙汁消费量，减少对进口的依赖，我国正逐渐从优化柑橘产业布局、增加汁用甜橙栽培面积和降低原料成本等方面促进橙汁产业发展。伴随着这种发展，我国急需建立和完善橙汁的质量和安全保障体系。由酵母菌污染引起的橙汁腐败是产业长期面临的主要问题之一，更是不添加防腐剂的NFC橙汁生产中亟待解决的关键问题之一。与致病菌的检测相比，国内针对食品中酵母菌检测的研究较少。目前，我国食品和饮料中的酵母菌检测仍采用传统的平板培养法，所需时间长、检测结果滞后，不能及时指导生产。因此，为有效控制酵母菌污染，建立一套快速、有效的酵母菌检测方法对我国橙汁的安全生产和消费都具有重要意义。
　　 本论文采用平板法分离橙汁中的酵母菌，通过形态观察、5.8SrDNA及其ITS间隔区序列RFLP分析和26SrDNAD1/D2区序列测定相结合的方法鉴定分离菌株。并且在改进DNA提取方法、优化PCR扩增体系的基础上建立了酵母菌PCR快速检测体系。主要研究结果如下：
　　 1.以63份腐败橙汁为材料，利用平板法进行微生物分离计数，测得腐败橙汁中酵母菌的浓度在104CFU/mL～107CFU/mL。进一步分析表明，104CFU/mL，酵母菌使橙汁呈现出胀瓶和变清等腐败特征，106CFU/mL～107CFIU/mL，酵母菌能使橙汁产品出现明显的胀瓶现象。
　　 2.对橙汁中主要的酵母菌进行了形态观察。Pichiafermentans在YPD培养基上生长，菌落表面呈现辐射分布的精致的条纹，可用于快速识别该种酵母。对菌株Y17-2和Y19菌落形态进行连续观察，发现酵母菌落形态是动态变化的，可通过特定时期出现的明显特征识别酵母菌。Pichia属的7株酵母菌可根据菌落形态差异分为6组，与核糖体DNA序列聚类分析的结果一致。也对Clavisporalusitaniae、Candidasake、Hanseniasporauvarum和Candidaparapsilosis等主要酵母污染菌在WL培养基上的菌落特征进行观察，这些菌落在颜色和形态上都有差异。研究结果表明：酵母在菌落特征上的差异与其核糖体DNA序列差异的结果一致。因此，采用菌落特征观察来鉴别橙汁中主要的腐败酵母菌是行之有效的快速鉴定方法之一。
　　 3.以107CFU/mL和104CFU/mL的Saccharomycescerevisiae菌液为材料，对细胞破碎方式进行比较后选择最佳破壁方法，并对研磨破壁时提取液的用量进行了优化。优化后的DNA提取方法如下：
　　 1.5mL样品在13000rpm离心3min收集菌体；80μL提取液、90mg石英砂研磨3min，加320μL提取液；水浴10min，加250μL6mol/LNaCl溶液和等体积的氯仿：异戊醇(24：1)去除杂质，然后无水乙醇沉淀DNA，最后用50μLddH2O溶解。
　　 4.以提取自104CFU/mL菌液的DNA为模板优化PCR扩增体系。对PCR各组分进行优化的结果是：dNTP0.2mmol/L、引物浓度各0.4μmol/L，rTaq酶1.5U/25μL-Mg2+1.5mmol/L，或者rTaq酶1U/25μL-Mg2+2.5mmol/L有利于检测低浓度酵母菌。
　　 5.以8株代表酵母菌为材料比较5.8S-ITS区RFLP分析、5.8S-ITS区测序分析和26SrDNAD1/D2区测序分析对酵母菌的鉴定效果。3种鉴定法方法的鉴定结果一致，表明5.8S-ITS区RFLP分析与D1/D2区序列测定结合可快速准确地鉴定酵母菌。从橙汁分离菌中鉴定出分属于17属的26种酵母，主要的酵母菌及其出现的频率如下：Clavisporalusitaniae(13％)、Candidasake(11％)、Saccharomycescerevisiae(11％)、Hanseniasporauvarum(7％)、Candidaparapsilosis(6％)和Meyerozymaguilliermondii(6％)。分离菌中有10种酵母菌在橙汁中少见报道，表明橙汁中酵母菌的种类多，值得进一步分析。
　　 6.以106CFU/mL～101CFU/mL菌液和接种橙汁为材料，用常规PCR、热启动PCR和荧光定量PCR进行检测。常规PCR可检测接种橙汁中104CFU/mL酵母菌，表明检测灵敏度比原有的常规PCR检测106CFU/mL酵母菌提高了100倍，比原有的DNA经纯化后检测105CFU/mL酵母菌的灵敏度提高了10倍；使用热启动PCR可检测103CFU/mL酵母菌，是提高检测灵敏度的方法之一。以真菌通用引物NL1/NL4为引物，荧光定量PCR可检测40fg酵母菌DNA，能检测菌液中101CFU/mL酵母，但只能检测接种橙汁中104CFU/mL的酵母菌，这表明荧光定量PCR检测灵敏度高于常规PCR，但仍受橙汁中的某些物质的抑制而无法检测低浓度的酵母菌。
　　 7.以7种已鉴定的橙汁分离酵母菌为材料，进行5.8S-ITS区熔解曲线分析，以考察能否用通过5.8S-ITS区熔解温度鉴别橙汁中的酵母菌。7种酵母菌5.8S-ITS区的熔解温度如下：Candidaparapsilosis(80.10±0.0℃)、Rhodotorulaglutinis(80.95±0.05℃)、Debarryomyceshansenii(81.70±0.0℃)、MeyerozymaguilliermondiiY56(82.60±0.0℃)、Candidaintermedia(83.80±0.0℃)、Hanseniasporasp.(84.20±0.0℃)、Pichiakluyveri(84.23±0.047℃)，结果表明熔解曲线分析结果准确，可用于区分熔解温度相差0.2℃的酵母菌。