热结肠道型气分证大鼠模型的构建及肠道黏膜免疫病理评价研究

摘要

近年来，畜禽养殖业出现了许多发热性疾病，给畜禽养殖业造成了巨大影响。中兽医学认为，发热性疾病均可应用清代医家叶天士创立的卫气营血理论进行辨证论治。其中，热结肠道型气分证是温病发展过程中的重要阶段之一，发病动物临床以发热，肠燥便干，粪结不通，尿短赤，口津干燥，口色深红，舌苔黄厚，脉沉实有力为主要特征。目前尚无成熟的热结肠道型气分证动物造模方法，且对热结肠道型气分证动物的肠道黏膜免疫机能的变化尚无系统研究，给研究发热性疾病的发生机制及中药研发带来了巨大困难。
　　因此，本研究通过对大鼠灌食热性中药及自家粪便，腹腔注射灭活大肠杆菌，建立热结肠道型气分证动物模型;并就对热结肠道型气分证大鼠肠道黏膜组织结构及功能变化，进行病理免疫学评价，确定肠道组织病理结构变化、相关细胞因子信使RNA(Messenger RNA，mRNA)表达情况，以确定热结肠道型气分证大鼠肠道黏膜机能的变化情况。结果表明:
　　1.可按照以下条件成功构建出热结肠道型气分证大鼠模型:
　　给大鼠口服1∶1∶1的附子、肉桂、干姜的热性中药12d，连续灌服自家粪便后，腹腔注射灭活大肠杆菌液后5h，大鼠可出现热结肠道型气分证动物症状:全身发抖、耸毛、卷缩、精神倦怠、结膜充血、呼吸急促、心率加快、饮水次数增加、尿量减少并发黄、排便时间延长，排便粒数减少、大便干结、并成圆珠状或串珠，耳廓血管充血扩张、体温升高及体重降低等。
　　2.热结肠道型气分证大鼠模型的肠道病理学评价如下:
　　肠道组织石蜡切片、苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，H-E染色)结果表明:在第5h时，大鼠十二指肠、空肠及回肠均出现了显著病理损伤，如十二指肠有显著的炎性细胞浸润，且固有层与上皮层出现空泡化，空肠和回肠均出现了黏膜脱落、炎性细胞浸润等病理损伤;同时，即十二指肠、空肠、回肠均出现了显著病理变化，其中以空肠组织损伤最为明显，进一步确定了热结肠道型气分证大鼠肠道组织结构特别空肠受损严重。
　　肠道黏膜上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte，IEL)数量表明:在第5h和7h时，十二指肠IEL数量均显著低于对照组(P＜0.05)，且第7h时，十二指肠IEL数量显著高于第5h(P＜0.05);在第5h时，空肠IEL数量显著低于对照组(P＜0.05)，其余组与对照组无显著差异(P＞0.05)。
　　肠道黏膜杯状细胞(Goblet Cell，GC)数量表明:模型组大鼠在十二指肠和空肠肠段GC数量变化趋势基本一致。在第5h和7h时，十二指肠IEL数量均显著低于对照组(P＜0.05)，且第7h时，十二指肠IEL数量显著高于第5h(P＜0.05);在第5h时，空肠IEL数量显著低于对照组(P＜0.05)，其余组与对照组无显著差异(P＞0.05)。
　　3.检测热结肠道型气分证大鼠肠道组织细胞因子mRNA表达量表明:
　　通过实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time Polymerase Chain Reaction，Real-time PCR)检测大鼠肠道组织中白细胞介素4(interleukin4， IL-4)、白细胞介素10(interleukin10， IL-10)、转化生长因子β(transform growth factorβ，TGF-β)、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、干扰素γ（interferon-γ）、免疫球蛋白A(imunoglobulin A，IgA)mRNA表达量，发现除IL-10在回肠和结肠表达量最高外，其余细胞因子均在十二指肠表达最敏感。
　　在气分证状态下，Th1型细胞因子的表达变化为:IFN-γ的mRNA表达除结肠外，十二指肠、空肠和回肠IFN-γ的mRNA表达均出现增强;TNF-α mRNA表达量以5h组十二指肠表达量最低，空肠、结肠组织以5h组TNF-α mRNA表达R子的表达变化为:IL-4 mRNA表达量在各肠道组织中均降低;IL-10 mRNA表达量在5h十二指肠与对照组无显著差异，回肠和空肠、结肠的表达量增强。
　　此外，肠道组织中IgA mRNA表达量以5h组十二指肠、空肠和回肠中升高，结肠组织降低;且以5h组十二指肠和结肠组织TGF-β mRNA表达量增强。空肠、回肠组织以5h组TGF-β mRNA表达量减弱。
　　综上所述，可通过给大鼠灌服12d热性中药和2d自家粪便后，腹腔注射灭活大肠杆菌液后5h，大鼠的各项临床症状符合中兽医热结肠道型气分证证候特征，即成功建立热结肠道型气分证动物模型。热结肠道型气分证状态下，大鼠肠道组织结构受到损伤，以空肠组织受损最为严重;且以十二指肠段组织的细胞因子IL-4、TGF-β、TNF-α、IFN-γ、IgA mRNA表达量最高，IL-10则在空肠和回肠中表达量最高，且肠道组织中细胞的Th1/Th2细胞免疫平衡向Th1细胞免疫方向失衡，组织炎性反应加重，而IgA等表达增加，体现了热结肠道型气分证动物肠道黏膜免疫处于增强状态，但有炎性反应加重趋势的特点。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1 热结肠道型气分证研究现状

2．中医对热结肠道型气分证的认识

3 热结大肠型气分证与动物疾病关系的研究现状

3．1 热结肠道型气分证与肠道黏膜免疫关系

3．2 热结肠道型气分证与肠源性内毒素血症的关系

4 气分证动物模型构建的研究现状

5 肠道黏膜免疫系统组成及功能

5．1 肠道黏膜免疫系统

5．2 效应性细胞因子在肠道黏膜免疫中作用

6 理论意义或实用价值

第二章 引言

第三章 热结肠道型气分证大鼠模型的构建条件研究

1 材料与方法

1．1 动物及分组

1．2 主要试剂及配制

1．3 仪器与设备

1．4 动物模型制作方法

1．5 样品采集与指标检测

1．6 数据处理与分析

2 结果

2．1 临床症状变化

2．2 灌服中药及粪便悬液期间大鼠体温及体重变化

2．3 注射大肠杆菌灭活菌液前后大鼠体温变化

2．4 大鼠饮水量及采食量变化

3 讨论与分析

3．1 大鼠临床症状变化

3．2 精神状态变化

3．3 口色、舌苔变化

3．4 饮水量、采食量、体重及粪便变化

3．5 体温变化

4．小结

第四章 热结肠道型气分证大鼠的肠道病理结构变化

1．材料与方法

1．1 动物及分组

1．2 主要试剂及配制

1．3 仪器与设备

1．4 试验方法

1．5 数据处理及分析

2 结果

2．1 注射灭活大肠杆菌液后大鼠不同肠段肠道组织结构变化

2．2 注射灭活大肠杆菌液后各组大鼠各肠段IEL、GC数量变化

3 分析与讨论

4 小结

第五章 热结肠道型气分证大鼠肠道组织IFN-γ、IL-4、IL-10、TNF-α、TGF-β及IgA的mRNA表达变化

1 材料与方法

1．1 动物及分组

1．2 主要试剂及配制

1．3 仪器与设备

1．4 试验方法

1．5 数据处理及分析

2．结果

2．1 RNA完整性检测

2．2 大鼠肠道组织中Th1型细胞因子mRNA表达量变化

2．3 大鼠肠道组织中Th2型细胞因子mRNA表达量变化

2．4 大鼠肠道组织中IgA mRNA表达量变化

2．5 大鼠肠道组织中TGF-β mRNA表达量变化

3 分析与讨论

3．1 肠道组织中Th1／Th2型细胞因子的变化

3．2 肠道组织中IgA mRNA表达变化

3．3 肠道组织中TGF-β mRNA表达量的变化

4．小结

第六章 结论

参考文献

附图

致谢

个人简介