基于ND4和微卫星标记的中国柑橘大实蝇种群遗传结构分析

摘要

柑橘大实蝇Bactrocera(Tetracus) minax(Enderlein)，又名中国果实蝇、柑蛆，是一种隶属于双翅目Diptera、实蝇科Tephdtida、果实蝇属Bactrocera Macquart的检疫性害虫，目前已在中国、印度、不丹和尼泊尔等亚洲国家报道发生。据现有统计数据表明，柑橘大实蝇在中国已在7省市主要发生为害，对柑橘生产造成了巨大的损失，故了解柑橘大实蝇的遗传结构，分析推测其扩散路径，对制定柑橘大实蝇的防控措施具有重大的意义。本研究通过扩增柑橘大实蝇1个线粒体DNA(mtDNA)基因片断和4个微卫星位点(microsatellite loci)，采用遗传多样性参数分析、系统发育树分析和谱系生物地理学分析等方法，首次对采自中国大陆18个不同地区的柑橘大实蝇种群进行系统而深入的比较研究，获得以下主要结论:
　　1.分子标记的确定
　　对于线粒体基因分子标记的选定，根据前人研究，我们以柑橘大实蝇线粒体的COX1、CYTB、ND4和ND5基因作为初选目标。然后，按照A+T含量(％)、多态性位点数、简约信息位点数、自裔位点数、单倍型数和核酸多样性等6种基因多样性指数，并结合去掉前后引物后基因片段长度必须要大于500bp的原则对其进行筛选分析，其中，四个线粒体基因片段的6种基因多样性指数分别为:COX1,56.40、56、30、26、7、0.0092; CYTB,61.74、40、23、17、5、0.0147;ND4,65.50、64、42、22、11、0.0116; ND5,66.20、36、22、14、9、0.0102。结果表明，ND4基因是这四个基因中在柑橘大实蝇上进化率最高的线粒体基因，故选择ND4基因片段来作为柑橘大实蝇线粒体分子标记。
　　2.微卫星标记的确定
　　为了高效筛选合适的微卫星引物进行柑橘大实蝇遗传结构研究，我们首先从柑橘大实蝇同属种柑橘小实蝇Bactrocera dorsalis、木瓜实蝇Bactrocera papayae、瓜实蝇Bactrocera cucurbita、东澳番茄实蝇Bactrocera cacuminata中挑选多态性较好的33对微卫星引物，再对其各PCR扩增产物进行琼脂糖电泳的初筛选，及6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的再筛选，之后对其等位基因频率、多态信息含量和有效等位基因数等指数进行了分析。最终筛选出6对在柑橘大实蝇多态性表现较好的微卫星引物，分别为位点Bp125(PIC=0.1546)、BcuB5.2(PIC=0.4105)、BcuF1.6(PIC=0.3086)、Bd47(PIC=0.0886)、Bcac5.10(PIC=0.2745)和Bcac6.12(PIC=0.1118)。最后，根据多重PCR条件的限制（两对目的基因片段长度差异要在30bp以上，且两对引物不能形成发夹结构或二聚体），选择了其中的4对引物（Bp125、BcuF1.6、Bcac5.10和Bcac6.12）来作为柑橘大实蝇的微卫星标记。
　　3.柑橘大实蝇遗传结构及遗传多样性
　　本实验共扩增了18个柑橘大实蝇种群的359个个体的ND4基因片段序列和478个个体的4个微卫星位点信息，其中在ND4基因中，共发现了93个变异位点，获得了91个单倍型;在4个微卫星位点上，则分别检测到7、14、9和8个等位基因，在各个种群上则各检测到19到30个等位基因不等，平均为23.06个等位基因。结果表明，18个柑橘大实蝇种群具有丰富的多态位点数和单倍型，且高度的等位基因杂合性也表明柑橘大实蝇的遗传多样性较高。
　　柑橘大实蝇的ND4序列集和微卫星数据集SAMOVA分析结果（柑橘大实蝇种群间的遗传变异在18个种群中所占比例较高，为38.01％）表明，柑橘大实蝇的遗传结构较弱。同时，18个柑橘大实蝇种群AMOVA对遗传固定系数Fsr分析结果表明，柑橘大实蝇种群间存在明显的遗传分化，但微卫星数据集的遗传固定系数值要比ND4序列集的偏低，其原因可能是柑橘大实蝇的纯合体偏多和在微卫星位点上出现了一些无效等位基因。
　　4.柑橘大实蝇在中国大陆的扩散中心及路径分析
　　结合18个柑橘大实蝇种群的ND4序列集和微卫星数据集的遗传分化系数、系统发育树、基因流分析结果，我们对柑橘大实蝇在中国大陆的扩散中心和主要扩散路径作出以下推断:
　　(1)通过对比邻近柑橘大实蝇种群间的遗传分化系数和基因流值，尤其是重庆5个种群间，因此，我们认为柑橘大实蝇可能具有某种“恋家”行为—即其不会主动由其定居的山区向四周扩散。
　　(2)对柑橘大实蝇3大组群和总体的遗传分化系数、系统发育树结构和基因流值（迁入率和迁出率的不对称性）分析发现，华南组群处于整个系统发育树的中部，组群的迁出率远大于其迁入率（分别为22.785和1.175），且与其他组群间的遗传分化系数较小，因此，我们认为华南组群应为柑橘大实蝇在中国大陆的扩散中心。
　　(3)同时，我们发现华中组群的十堰种群在18个柑橘大实蝇种群中处于特殊位置，十堰与其他种群的遗传分化值相较其他种群间较小，且十堰种群的基因流也为主迁出，故我们认为十堰应为柑橘大实蝇在中国大陆的“桥头堡”。
　　综上所述，我们推测柑橘大实蝇在华南开始向外扩散，后经华中的十堰为“中转站”，向华中其他地区和西部地区扩散，特别是向西南地区扩散。
　　5.重庆柑橘大实蝇的来源地分析
　　对于柑橘大实蝇主发生地之一，我们对柑橘大实蝇在重庆的扩散模式和种群间的遗传关系进行了分析。重庆5个种群（武隆、忠县、万州、云阳和巫山种群）间，几乎没有共享单倍型，且Structure分析结果显示，忠县种群应为华南种群近几年传入，而武隆、万州和巫山这3个种群则与华中的荆州种群遗传结构近似，至于云阳种群遗传结构则与十堰和宜昌种群近似。故重庆的柑橘大实蝇为分3条路径，分别由华南，华中的荆州和十堰传入。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1．1 柑橘大实蝇的研究进展

1．1．1 柑橘大实蝇的地理分布

1．1．2 柑橘大实蝇的生物学习性

1．1．3 柑橘大实蝇的生理学研究现状

1．1．4 柑橘大实蝇的分子生态学

1．1．5 柑橘大实蝇的防治

1．2 种群遗传结构的研究进展

1．2．1 遗传标记的选择

1．2．2 处理软件的选择

1．2．3 分析方法的选择

1．3 分子标记在种群遗传结构分析上的研究进展

1．3．1 线粒体DNA分子标记的研究进展

1．3．2 微卫星标记的研究进展

引言

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．2 主要材料与仪器

2．2．1 主要材料

2．2．2 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 基因组DNA提取

2．3．2 PCR扩增

2．3．3 电泳

2．3．4 基因克隆

2．4 分析软件

2．4．1 线粒体DNA序列分析

2．4．2 微卫星多态性分析软件

第三章 柑橘大实蝇线粒体基因和微卫星标记的筛选

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 试剂及仪器

3．1．3 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 线粒体分子标记筛选

3．2．2 微卫星标记筛选

3．3 讨论

3．3．1 线粒体分子标记的选择

3．3．2 微卫星标记的选择

第四章 柑橘大实蝇在中国大陆的主要扩散路线

4．1 材料与方法

4．1．1 采样

4．1．2 试剂及仪器

4．1．3 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 遗传多样性分析

4．2．2 种群遗传结构分析

4．2．3 基因流(Nem=θ×M)分析

4．2．4 种群系统发育分析

4．2．5 群口演化历史分析

4．3 讨论

4．3．1 种群结构和遗传多样性

4．3．2 基因流

4．3．3 群口演化历史

4．3．4 主要扩散路径

第五章 主要结论与展望

5．1 主要结论

5．1．1 分子标记的选定

5．1．2 微卫星标记的选定

5．1．3 柑橘大实蝇遗传结构及遗传多样性

5．1．4 柑橘大实蝇在中国大陆的扩散中心及路径分析

5．1．5 重庆柑橘大实蝇的来源地分析

5．2 本研究的创新与不足之处

5．3 展望

参考文献

附录

附录Ⅰ-1 柑橘大实蝇微卫星等位基因分型部分毛细管图

附录Ⅰ-2 柑橘大实蝇微卫星等位基因分型的分型结果

附录Ⅰ-3 柑橘大实蝇种群在ND4基因单倍型构成

致谢

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