真菌多重PCR方法的建立及其在深部真菌感染中应用

摘要

目的：⑴利用真菌通用引物—转录间隔区(ITS)和常见致病真菌属或种特异性引物，建立真菌多重PCR反应体系。⑵探讨真菌多重PCR方法对深部真菌感染的初步应用价值。 方法：①将毛孢子菌、枝孢霉、念珠菌、着色霉、镰刀菌、新生隐球菌、曲霉、毛癣菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，制成(1-5)×106 cfu/mL菌悬液，分别与人血、尿液、脑脊液混合制作模拟体液。取模拟体液300μL，提取真菌DNA，用ITS或曲霉属、镰刀菌属、毛孢子菌属、白念珠菌、新生隐球菌特异性引物单重PCR检测真菌DNA特异性，ITS检测真菌DNA灵敏度。②用ITS、曲霉属、镰刀菌属、毛孢子菌属、白念珠菌、新生隐球菌特异性引物进行多重PCR组合，检测模拟体液中真菌DNA。③收集30例临床可疑深部真菌感染患者的体液标本，作直接涂片和真菌培养，同时提取DNA作ITS单重PCR和四重PCR; ITS阳性扩增产物送广州华大基因公司作DNA测序，用Blast软件与GenBank中真菌序列进行比对，从而鉴定菌种。 结果：⑴真菌特异性引物检测真菌DNA特异性:ITS、曲霉属、镰刀菌属、毛孢子菌属、白念珠菌、新生隐球菌特异性引物分别扩增出模拟体液中500～600 bp、234 bp、516 bp、170 bp、257 bp、135 bp目的片段，但2种细菌和人血细胞DNA均未见目的片段。⑵ITS检测真菌DNA灵敏度:将真皮毛孢子菌制成1×101-7 cfu/mL悬液，用ITS引物扩增真皮毛孢子菌DNA，发现最低检测量为100 cfu/mL。⑶多重PCR方法的建立:经过引物反复配对筛选，发现下述组合可以成功。①二重PCR: ITS与五对属或种特异性引物中任何一对引物;②三重PCR:ITS+镰刀菌属+白念珠菌，ITS+镰刀菌属+新生隐球菌，ITS+毛孢子菌属+白念珠菌，ITS+毛孢子菌属+新生隐球菌，ITS+白念珠菌+新生隐球菌;③四重PCR:ITS+毛孢子菌属+白念珠菌+新生隐球菌。⑷临床应用:30例标本中真菌培养阳性8例，ITS扩增阳性和四重PCR体系扩增阳性各13例，真菌培养、PCR检测的阳性率分别为26.7％、43.3％，两种方法的检出率差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论：①ITS、曲霉属、镰刀菌属、毛孢子菌属、白念珠菌、新生隐球菌引物均有良好特异性。②单重和四重PCR敏感性高、特异性强、稳定性好、耗时短，可为深部真菌感染的早期诊断提供病原学依据。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

综述 多重PCR对真菌感染的快速检测研究现状

致谢

附录一：缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况