细胞外热休克蛋白70对小鼠血清血管生成素-2水平及肺血管通透性的影响

摘要

[目的]
　　最新研究表明:机体在受到创伤后，能释放一类具有免疫活性调节作用的内源性物质称为损伤相关模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）分子[1]。肺内皮细胞是肺部创伤炎症反应的关键细胞，其中血管生成素2(Ang-2)是内皮细胞功能障碍的重要生物标记物。本课题前期体外实验研究发现:细胞外热休克蛋白70(eHSP70)可以诱导内皮细胞Ang-2合成及分泌增加。此效应可能通过eHSP70与内皮细胞表面上的Toll样受体2(TLR2)等多种受体结合发挥其作用。因此，本实验将进一步探讨:1、eHSP70是否对小鼠肺血管通透性及肺组织病理产生影响;2、eHSP70是否影响小鼠血清Ang-2水平;3、初步探讨eHSP70在体内引起Ang-2浓度变化的调节机制。这些研究将为寻找创伤后内皮功能障碍治疗的新手段提供理论依据。
　　[方法]
　　本课题分两部分实验进行。第一部分实验分组，选取6-8周龄SPF级雄性昆明小鼠24只，随机分为对照组、eHSP70组、eHSP70+TL2.1(TLR2阻滞剂)组;第二部分实验分组，选取6-8周龄SPF级雄性昆明小鼠24只，随机分为对照组、eHSP70组、 eHSP70+PMSF(磷脂酶C阻滞剂)组。药物使用方法及剂量分别如下:eHSP70按0.022μg/g剂量经鼠尾静脉注射，TLR2阻滞剂按1.5mg/kg剂量亦经鼠尾静脉注射，而磷脂酶C(PLC)阻滞剂需在使用eHSP70前30分钟按30mg/kg剂量予以腹腔注射。所有小鼠在实验12小时前禁食，6小时前禁水。治疗后恢复正常饮食。观察6小时后麻醉收集小鼠血液（眼球采血）用ELISA测定小鼠血清Ang-2浓度;开胸取左肺组织用HE染色观察小鼠肺组织病理改变、用免疫组化法测定肺组织TLR2及PLC蛋白表达量，取右肺组织用伊文思蓝法测定小鼠肺血管通透性。应用SPSS20.0软件对所有数据进行统计分析，结果采用(x)±s表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　[结果]
　　1、各组小鼠肺血管通透性评估
　　第一部分实验:与对照组相比，eHSP70组伊文思蓝漏出量增加，差异具有统计学意义（10.61±1.59 VS79.26±7.45，P＜0.05）。eHSP70+TL2.1组伊文思蓝漏出量低于eHSP70组（53.13±7.10 VS79.26±7.45，P＜0.05），但仍高于对照组(53.13±7.10 VS10.61±1.59，P＜0.05)。
　　第二部分实验:与对照组相比，eHSP70组伊文思蓝漏出量增加，差异具有统计学意义(10.89±1.60 VS81.67±9.13，P＜0.05)。eHSP70+PMSF组伊文思蓝漏出量低于eHSP70组（42.16±8.66 VS81.67±9.13，P＜0.05），但仍高于对照组(42.16±8.66 VS10.89±1.60, P＜0.05)。
　　2、各组小鼠血清Ang-2浓度变化
　　第一部分实验:与对照组比较，eHSP70组Ang-2浓度显著升高，差异具有统计学意义(13.88±1.36ng/ ml VS2.65±0.47ng/ml，P＜0.05)。与eHSP70组对比，eHSP70+TL2.1组Ang-2浓度显著减少(8.10±1.01ng/ml VS13.88±1.36ng/ml，P＜0.05)，但仍高于对照组(8.10±1.01 ng/ml VS2.65±0.47ng/ml，P＜0.05)。
　　第二部分实验:与对照组比较，eHSP70组Ang-2浓度显著升高，差异具有统计学意义(13.96±1.23ng/ml VS2.66±0.51ng/ml，P＜0.05)。与eHSP70组对比，eHSP70+ PMSF组Ang-2浓度显著减少(10.85±1.00ng/ml VS13.96±1.23ng/ml，P＜0.05)，但仍高于对照组（10.85±1.00ng/ml VS2.66±051ng/ml，P＜0.05）。
　　3、各组小鼠肺组织病理变化
　　第一部分实验:eHSP70组病理评分高于对照组(5.67±0.52 VS1±0.63，P＜0.05); eHSP70+TL2.1组病理分数低于eHSP70组(3.17±0.41 VS5.67±0.52，P＜0.05)，但仍高于对照组（3.17±0.41 VS1±0.63，P＜0.05）。
　　第二部分实验:eHSP70组病理评分高于对照组(6.33±0.52 VS1.12±0.75，P＜0.05);eHSP70+PMSF组病理分数也低于eHSP70组(3.5±0.55 VS6.33±0.52，P＜0.05)，但仍高于对照组（3.5±0.55 VS1.12±0.75，P＜0.05）。
　　4、第一部分小鼠肺组织TLR2蛋白表达水平
　　对照组TLR2蛋白呈弱阳性表达;TLR2蛋白在eHSP70组内皮细胞中的表达显著增强，为强阳性。预处理TL2.1后，eHSP70+TL2.1组TLR2蛋白的表达水平均较eHSP70组下降。
　　5、第二部分小鼠肺组织PLC蛋白表达水平
　　对照组PLC蛋白呈弱阳性表达;PLC蛋白在eHSP70组内皮细胞中的表达显著增强，为强阳性。预处理PMSF后，eHSP70+ PMSF组PLC蛋白的表达水平均较eHSP70组下降。
　　[结论]
　　1、eHSP70可以导致小鼠肺血管通透性增加，引起肺组织出现肺水肿及炎症渗出;
　　2、eHSP70可以诱导小鼠血清Ang-2水平增高;
　　3、eHSP70可能通过与内皮细胞表面上的TLR2和PLC受体结合引起小鼠以上变化。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

综述 线粒体功能障碍及保护在多器官功能衰竭中作用

致谢

附录

在读期间的科研情况