猪呼吸道疾病综合征六种病原基因芯片检测方法的建立

摘要

猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）是由病毒、细菌、支原体、寄生虫及环境应激等多种因素引起，以呼吸困难、咳嗽、发热、生长迟缓等为临床特征的一类猪常见疾病。病原学分析发现，引起PRDC的主要病原包括猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）、猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2,PCV-2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）等，其中APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV六种病原在我国较为常见，规模化养猪中多病原的混合感染或继发感染大大增加了临床诊断的难度。目前，对APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV六种病原的检测多进行单一病原的分离培养、血清学检测、PCR扩增等，缺少可同步鉴别检测六种病原的方法。因此，建立一种可同时检测PRDC六种重要病原的方法，节省成本，提高检测效率，对猪病的流行病学调查、疫病监控、进出境检疫等具有重要意义。本研究以APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV作为研究对象，建立了可同步鉴别检测六种病原的基因芯片，该方法具有较好的特异性和稳定性。其主要研究内容及结果如下：
　　1.引物和探针的设计
　　根据GenBank中登录的APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV的基因序列，使用生物学软件Mega5、Primer Premier5.0和Oligo6.0进行分析比对、设计6对特异性引物和多条探针。对六种病原核酸进行PCR扩增，构建T-克隆载体，基于电泳检测和测序比对结果筛选阳性质粒。
　　2.探针筛选和单一病原基因芯片检测方法的建立
　　参考GeXP的标记方法，对靶序列进行Cy3荧光标记，与固定于醛基基片表面的探针进行避光杂交，扫描杂交结果，筛选特异性高且荧光信号强的探针。在探针筛选的基础上，进行退火温度、外循环次数、杂交探针浓度、杂交液、杂交温度和杂交时间的优化，确定退火温度为56～58℃和外循环25～30次进行扩增，PCR产物与自配杂交液混合，42℃避光杂交3h。对单一病原基因芯片检测方法的特异性、敏感性、稳定性进行评估，结果显示：该方法具有较好的特异性和稳定性，其中敏感性分别为APP2.97×102拷贝/μL、HPS4.38×103拷贝/μL、Mhp8.26×102拷贝/μL、PCV-23.78×102拷贝/μL、PRRSV1.38×103拷贝/μL、CSFV3.32×10拷贝/μL。该方法的检测敏感性与普通PCR扩增相比高10～100倍。
　　3.六种病原基因芯片单管同步检测方法的建立和初步应用
　　在单一病原基因芯片检测方法的基础上，通过正交试验优化六种病原特异性嵌合引物的浓度，初步建立六种病原同步检测的基因芯片方法。优化杂交温度和时间，进行方法评估。
　　特异性试验：对伪狂犬病病毒、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒、猪水疱病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒和沙门氏菌的核酸进行扩增杂交，验证构建芯片的特异性。结果显示，该方法与上述病原均无交叉反应。
　　敏感性试验：将六种病原的阳性质粒进行混合后倍比稀释，以其为模板进行敏感性试验。结果显示：APP5.8×102拷贝/μL、HPS7.8×103拷贝/μL、Mhp6.8×103拷贝/μL、PCV-26.3×102拷贝/μL、PRRSV4.8×103拷贝/μL、CSFV5.5×102拷贝/μL。因此，综合考虑六种病原的检出限，多病原单管同步检测基因芯片的敏感性为103拷贝/μL。
　　重复性试验：选取同一批次制备的6张基片和不同批次制备的6张基片，进行组内和组间重复性试验。结果显示：组内组间试验均具有较高的可重复性。
　　保存期试验：本试验进行了为期4个月的保存期试验，确定芯片的最优保存条件。结果显示：该方法制备的芯片至少可在-20℃条件下保存4个月。
　　临床初步应用：对重庆地区采集的186份样品分别使用本研究建立方法与现行标准方法进行对比分析，结果显示：基因芯片方法检出单一病原感染34份，多病原混合感染11份；现行标准方法检出单一病原感染28份，多病原混合感染13份。将两种方法检出的阳性样品进行测序分析，测序结果与基因芯片方法检出结果一致，说明基因芯片方法可用于多种病原的临床鉴别检测。
　　本研究建立了一种可同步鉴别检测APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV六种重要病原的基因芯片方法，为基因芯片在动物疫病中的研究和应用提供理论基础，也为PRDC病原的鉴别检测提供技术支撑。