自噬在温和型热应激诱导仔猪睾丸支持细胞乳酸生成中的作用

摘要

由支持细胞（Sertoli cell，SC）分泌的乳酸（lactate）除了能作为生精细胞在生精小管的首选能量底物外，还具有抗凋亡作用，其合成过程需要GLUTs（glucose transporters，葡萄糖转运载体）、LDHs（lactate dehydrogenases，乳酸脱氢酶）和MCTs（monocarboxylate transporters，单羧酸转运蛋白）的共同参与。然而各个阶段的生精细胞对高温都十分敏感，在高温环境中，热应激（Heat Stress）就可导致生精细胞凋亡和支持细胞功能的损伤，但细胞内同时存在另外一个机制—自噬（Autophagy），对细胞稳态和功能恢复具有重要作用。自噬可以可在热应激条件下激活，同时还具有清除细胞内受损的蛋白，产生小分子物质的作用，因此，研究热应激诱导的自噬，对研究支持细胞的乳酸分泌及其相关蛋白表达具有重要意义。然而热应激不仅可以导致自噬，还可以诱导细胞发生凋亡（Apoptosis），因此，本实验还需通过对自噬对凋亡的影响，研究热应激状态下支持细胞的存活状态及趋势，然而两者间的相互关系还不完善。本实验的研究目的是探索热应激对支持细胞自噬的影响，及其调节乳酸合成和凋亡的分子机制。
　　本研究的实验材料为体外培养的仔猪睾丸支持细胞，通过培养箱43 ℃内处理30 min，再在32 ℃条件以0 h、12 h、24 h、36 h和48 h对细胞进行恢复，来构建热应激模型。利用免疫荧光检测自溶酶体的表达，流式细胞术检测凋亡率，乳酸检测试剂盒检测乳酸浓度，western blot和qRT-PCR检测LC3B-II/LC3B-I（对应基因LC3B）、Cleaved-Caspase-3（对应基因CASP3）、GLUT3（对应基因SLC2A3）、LDHA（对应基因LDHA）和MCT1（对应基因SLC16A1）的蛋白水平和基因的变化趋势。
　　实验结果：
　　（1）热应激后，支持细胞的LC3B-II/LC3B-I和LC3B的水平，在0-48 h呈现出时间依赖性，在24 h两者相对于对照组分别显著上升30.25％和257%。同时24 h的自溶酶体的红色荧光比其他组的亮度都强（P<0.01）。
　　（2）乳酸分泌量、GLUT3（SLC2A3）、LDHA（LDHA）和MCT1（SLC16A1）在热应激后，也呈现出时间依赖性，且24 h具有最大值（P<0.01）。
　　（3）热应激后，支持细胞的凋亡率、Cleaved-Caspase-3和CASP3，在0-48 h同样呈现出时间依赖性，然而其峰值出现在12 h，相对于对照组分别显著增长49%、65.63%和43.27%（P<0.01）。
　　（4）LY294002（20μM）对自溶酶体的形成和LC3B-II/LC3B-I（LC3B）的表达具有显著抑制作用（P<0.01）。
　　（5）LY294002（20μM）显著导致凋亡率上升，并促进Cleaved-Caspase-3和CASP3的表达（P<0.01）。
　　（6）LY294002（20μM）显著促进了支持细胞乳酸的分泌量，以及GLUT3（SLC2A3）、LDHA（LDHA）和MCT1（SLC16A1）的表达（P<0.01-0.05）。
　　综上，热应激通过诱导支持细胞自溶酶体的形成和LC3B-II/LC3B-I（LC3B）的表达，抑制了细胞的凋亡率和Cleaved-Caspase-3（CASP3）的启动，并通过促进GLUT3（SLC2A3）、LDHA（LDHA）和MCT1（SLC16A1）的表达，促进支持细胞的乳酸分泌。这一结论可将自噬作为靶点，为精子质量和精子数量的提高作为研究依据。

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第一章 文献综述

1.热应激的研究进展

2.自噬的研究概况

3.支持细胞分泌的乳酸与精子生成

4.小结

第二章 引言

第三章 实验材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

3.统计分析

第四章 实验结果

1.支持细胞total RNA完整性检测

2.荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线分析

3.热应激对支持细胞自噬的影响

4.热应激诱导的自噬对凋亡的影响

5.热应激诱导的自噬对支持细胞乳酸合成的影响

6.LY294002抑制支持细胞自噬

7.LY294002抑制自噬后对凋亡的影响

8.LY294002抑制自噬后对乳酸合成的影响

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢