桔小实蝇细胞色素P450酶系及其在马拉硫磷抗性中的作用

摘要

桔小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）是热带和亚热带地区严重危害果蔬的重要经济害虫，对农业生产带来不可估计的损失。由于长期化学防治的压力，桔小实蝇对常用杀虫剂包括有机磷类杀虫剂已产生了不同程度的抗性。前期研究表明，细胞色素P450在昆虫对有机磷类杀虫剂代谢抗性中起重要作用，而且根据增效试验以及代谢酶活性测定，桔小实蝇细胞色素P450与有机磷类杀虫剂如马拉硫磷的代谢抗性密切相关。据此，为揭示桔小实蝇细胞色素P450介导代谢抗性的分子机理，本学位论文首先克隆获得了桔小实蝇P450基因cDNA全长序列，全面了解桔小实蝇P450基因的序列信息；定量分析了P450基因在桔小实蝇体内的表达分布特点和应对外源物的反应；克隆获得桔小实蝇细胞色素P450还原酶基因，定量分析了BdCPR表达分布特点，并通过RNAi和真核表达等技术，探究桔小实蝇细胞色素P450还原酶基因与马拉硫磷抗性的关系，进而初步判断P450酶系在桔小实蝇马拉硫磷抗性中的作用；通过转录组RNA-Seq技术，分析比较了桔小实蝇成虫及其中肠和脂肪体在马拉硫磷抗性品系和敏感品系间表达量的差异，筛选鉴定出桔小实蝇中与马拉硫磷抗性相关的基因；最后，结合RNAi和真核表达等技术分析P450基因在马拉硫磷抗性中的作用。本研究为桔小实蝇的代谢抗性分子机理建立理论基础，主要研究结果如下：
　　1.桔小实蝇细胞色素P450基因的克隆与序列分析
　　通过简并引物、转录组数据库和RACE技术，共克隆和鉴定出桔小实蝇38个具有完整开放阅读框的细胞色素450基因。这38个P450基因分布于4个集团14个家族27个亚家族中，其中CYP2、CYP3、CYP4和mitochondrial集团分别有2个、19个、11个和6个P450基因，第四家族和第六家族P450基因分别为11个和12个，第12家族为4个，其他11个家族均为1个。38个P450基因的开放阅读框长度介于1350-1665 bp，编码489-554个氨基酸。编码蛋白的分子量介于57-64 kDa，理论等电点介于5.88-9.62。通过对序列的分析，预测38个P450中有32个属于微粒体P450，6个为线粒体P450。
　　桔小实蝇38个P450基因均获得细胞色素P450命名委员会命名，分别为CYP4AC4、CYP4AD1、CYP4D46、CYP4D47、CYP4D48、CYP4E9、CYP4G100、CYP4G101、CYP4P5、CYP4P6、CYP4S18、CYP6A41、CYP6A48、CYP6A49、CYP6A50、CYP6A61、CYP6A62、CYP6D9、CYP6D12、CYP6EK1、CYP6G6、CYP6G8、CYP6GX1、CYP9F6、CYP12A18、CYP12B3、CYP12C2、CYP12N1、CYP28F1、CYP302A1、CYP304A1、CYP305A1、CYP309B1、CYP310C1、CYP314A1、CYP317B1、CYP437A3和 CYP3074A1，并在 GenBank中登录，登录号依次为 ADC44464、KX708477、ADC44459、ADP22308、ADP22303、ADP22302、KX708478、KX708479、ADC44461、AFH54172、KX708480、ADP22304、KX708481、KX708482、KX708483、KX708484、KX708485、ADO24531、KX708486、ADP22309、KX708487、KX708488、KX708489、KX708490、KX708491、KX708492、AFH54190、AFH54188、AFH54196、AFH54200、KX708493、KX708494、KX708495、AFH54207、AFH54210、KX708496、KX708497和KX708498。
　　多重序列比对显示11个CYP4家族成员的氨基酸序列一致性介于25％-67%，12个CYP6家族成员的氨基酸序列一致性介于26%-60%，相同亚家族成员的序列一致性较高，而不同家族的P450基因序列一致性普遍较低。这些P450基因均具有P450大家族的保守结构域Helix C、Helix I、Helix K、Meander和血红素结合区域等。桔小实蝇 P450基因与实蝇类害虫橄榄实蝇、瓜实蝇和地中海实蝇的同源P450基因氨基酸序列的一致性分别介于79%-97%、74%-95%和70%-94%，序列相似性非常高，与果蝇同源 P450基因的序列一致性介于35%-78%。系统发育分析显示38个P450基因和87个果蝇P450基因按集团聚集成4个不同的分支，其中CYP3和CYP4集团的两个分支基因最多，相同家族以及同源基因距离较近。
　　2.桔小实蝇细胞色素P450基因的表达模式解析
　　运用qPCR技术，定量检测了桔小实蝇P450基因在不同地理种群、不同发育阶段、不同组织以及雌雄成虫及其中肠间的表达量差异。结果显示，在桔小实蝇云南、海南、东莞和广州等4个种群中，CYP6P5在东莞和广州种群的表达量高于在云南和海南种群的表达量，CYP6EK1则在广州种群的表达量最高，其余6个被检测的P450基因在4个种群的表达量无显著差异。在桔小实蝇卵、幼虫、蛹和成虫中，数字表达谱数据显示不同P450基因在数据库中可以对应1-4个片段，相同基因的不同片段对应的不同发育阶段的表达量非常相似，而且与定量检测结果一致（CYP4D47除外）；8个检测的P450基因均在幼虫和成虫阶段的表达量较高，其次是蛹期，而在卵期的表达量则普遍最低；相同亚家族的P450基因CYP4D46、CYP4D47和CYP4D48在不同发育阶段的表达模式具有差异。在桔小实蝇成虫不同组织（中肠、脂肪体和马氏管）中，相同亚家族的CYP4D46、CYP4D47和CYP4D48在中肠的表达量最高，表达模式非常相近；CYP4AC4和CYP4E9在脂肪体的表达量最高，CYP4P5和CYP6EK1在马氏管的表达量最高，P450基因在组织间的表达差异可达到750倍，而CYP6A41在3种组织的表达量无显著差异。在桔小实蝇3日龄雌雄成虫中，检测的15个P450基因的表达量均无雌雄差异；而在桔小实蝇雌雄成虫中肠，CYP12N1在雌虫中肠的表达量是其在雄虫中肠表达量的0.28倍，显著低于在雄虫中肠的表达量，其他14个P450基因在雌雄中肠间无明显差异。
　　此外，检测了桔小实蝇P450基因在外源物处理下的应激反应。使用高效氯氰菊酯LD50处理成虫24 h后，15个P450基因的表达量均无显著变化；而在成虫中肠，CYP4AC4、CYP4D46、CYP4P6和CYP302A1的表达量在高效氯氰菊酯处理后均下降，分别为对照组的0.33、0.37、0.61和0.53倍，其他11个P450基因的表达量在高效氯氰菊酯处理后无明显变化。使用含3 g/L和10 g/L植物次生物质柠檬醛的饲料饲喂桔小实蝇成虫，24 h后的死亡率分别为2%和30%；CYP4D46在3 g/L柠檬醛处理后表达量下降，CYP12N1、CYP302A1和CYP314A1在两种浓度柠檬醛处理后表达量均下调，而CYP28F1在3 g/L柠檬醛处理后表达量上升，CYP4D48和CYP6D9在10 g/L柠檬醛处理后表达量升高，但增加幅度均较小。
　　3.桔小实蝇细胞色素P450还原酶基因的克隆与功能研究
　　通过简并引物、转录组数据和RACE技术，扩增出桔小实蝇细胞色素P450还原酶BdCPR的两个转录本BdCRP-X1和BdCPR-X2，开放阅读框长度为2019 bp和1674 bp，分别编码672个和557个氨基酸。BdCPR-X1和BdCPR-X2编码蛋白的理论分子量为76 kDa和64 kDa，理论等电点为5.51和7.23。两个转录本的N端序列不同，而C端则一致。BdCPR-X1含有CPR完整的功能结构域FMN、FAD和NADPH，其N端具有膜锚定区域；而BdCPR-X2具有功能结构域FMN、FAD和NADPH，但FMN不完整，且不具有N端的膜锚定序列。桔小实蝇BdCPR-X1和BdCPR-X2的氨基酸序列与其他物种的CPR氨基酸序列具有较高的一致性。其中，与瓜实蝇和地中海实蝇CPR序列的一致性超过90%，与家蝇和果蝇的CPR序列的一致性也超过了80%，与哺乳动物如人的CPR序列的一致性达到了56%。系统发育分析得出 BdCPR与另外两个实蝇科昆虫的CPR距离较近，其中与瓜实蝇CPR的距离最近，与地中海实蝇CPR的距离次之。
　　BdCPR-X1是CPR在桔小实蝇存在的主要形式。BdCPR-X1在桔小实蝇羽化前相对表达量较低，蛹期最低，在成虫阶段随着日龄增加而逐渐升高；BdCPR-X2在不同发育阶段的表达量一直很低。BdCPR-X1在羽化后3日龄雌雄成虫间的表达量相似，而在9日龄雄虫的表达量显著高于雌虫的表达量，且均高于其在3日龄雌雄成虫的表达水平；而BdCPR-X2在3日龄和9日龄雌雄成虫的表达量均很低且无明显差异。BdCPR-X1在雌雄成虫头、胸和腹部的表达水平相近，在雄虫中肠、脂肪体和马氏管的表达量相对较高，在雌虫脂肪体和马氏管的表达量较高，而在雌雄生殖器官（卵巢、精巢和雄性附腺）的表达量较低；BdCPR-X2在桔小实蝇雌虫成虫不同体段和组织的表达分布与BdCPR-X1相似，但相对表达量较低。BdCPR-X1和BdCPR-X2在桔小实蝇马拉硫磷抗性品系和敏感品系的表达量无显著差异。
　　利用RNAi技术，体外合成BdCPR的dsRNA并注射到羽化后3日龄成虫腹部，72 h后BdCPR在成虫的表达量下降了52%，且差异显著，而注射PBS和对照的BdCPR表达量相近；注射后72 h的成虫在马拉硫磷LD50浓度下处理24 h后，对照组的死亡率为45.0%，注射PBS则为50.5%，而注射dsRNA组的死亡率达到了89.9%，且显著高于其他两组，表明 BdCPR表达量下降可以增强桔小实蝇对马拉硫磷的敏感性。利用 Bac-to-bac真核表达系统在 Sf9细胞中分别表达 BdCPR和eGFP，Western杂交显示BdCPR和eGFP在细胞中表达，且表达有BdCPR的细胞具有很高的细胞色素c还原性，而表达有eGFP以及对照组细胞的细胞色素c还原性则很低，表明BdCPR的表达产物在Sf9细胞中具有较高的活性；使用马拉硫磷处理细胞并用MTT法检测细胞活性，发现表达有BdCPR细胞的活性普遍高于表达有eGFP的细胞，表明BdCPR可能有助于增强Sf9细胞对马拉硫磷的耐受能力。
　　4.桔小实蝇马拉硫磷抗性敏感品系转录组比较分析
　　基于转录组数据库，构建了桔小实蝇马拉硫磷抗性和敏感品系成虫和成虫中肠的数字表达谱，以及新建了马拉硫磷抗性和敏感品系成虫脂肪体的转录组数据库。6个数据库的质量整体很好，每个样品的clean reads占raw reads的93%以上。分别比较了抗性和敏感品系成虫、抗性和敏感品系成虫中肠、抗性和敏感品系成虫脂肪体间基因的表达量差异。桔小实蝇马拉硫磷抗性品系成虫相比于敏感品系成虫（RWB/SWB），表达量上调的基因有141个，下调的基因有278个；马拉硫磷抗性品系成虫中肠与敏感品系成虫中肠（RMG/SMG）相比，表达量上调的基因有50个，下调的基因有988个；马拉硫磷抗性品系成虫脂肪体相比于敏感品系成虫脂肪体转录组（RFB/SFB），表达量上调的基因有349个，下调的基因有1,192个。
　　差异表达基因的GO分析表明这些基因涉及不同的生物过程、分布于不同的细胞组分以及具有不同的分子功能。差异基因的通路分析表明这些基因分布于代谢通路等主要通路上。马拉硫磷抗性品系成虫上调基因中包括2个 P450基因CYP6G6和CYP6A2-like，以及1个GST基因，分别上升至9.8、2.2和2.8倍；下调基因中包括4个P450基因和2个CarE基因。马拉硫磷抗性品系成虫中肠下调基因包括5个GST基因、2个CarE基因和15个P450基因。马拉硫磷抗性品系成虫脂肪体上调基因包括15个P450，上升至2.3-4.3倍（CYP6G6，4.3倍；CYP6A61，4.0倍；CYP4E1-like，3.8倍；CYP6G8，3.4倍；CYP437A3，3.3倍；CYP4D46和CYP309B1，3.0倍；CYP4AC4和 CYP12B3，2.9倍；CYP6A13-like，2.8倍；CYP12A4-like，2.7倍；CYP4S18，2.6倍；CYP6D9和 CYP12N1，2.4倍；CYP12A5-like，2.3），cytochrome b5，上升至2.1倍，以及两个GST基因，分别上升至2.7和2.8倍；下调基因中包括有6个P450基因。
　　5.CYP6G6在桔小实蝇马拉硫磷抗性中的作用
　　CYP6G亚家族与昆虫抗性密切相关，桔小实蝇CYP6G6氨基酸序列分别与果蝇CYP6G1、CYP6G2和家蝇CYP6G4氨基酸序列具有47%、51%和48%的一致性，底物结合位点SRS1-SRS6在4个CYP6G基因间相似性较高，且具有保守的氨基酸。定量结果显示 CYP6G6基因在桔小实蝇马拉硫磷抗性品系成虫的表达量是其在敏感品系成虫的5.2倍，且差异显著，这与桔小实蝇成虫表达谱数据和成虫脂肪体转录组数据一致。此外，CYP6G6在桔小实蝇成虫头部的表达量较胸部和腹部高，在腹部的脂肪体表达量较高，但无雌雄差异，而其在生殖器官精巢和卵巢的表达量较低。CYP6G6在桔小实蝇成虫的表达量从羽化后3日龄开始随着日龄的增加而逐步提高。
　　利用RNAi技术，注射CYP6G6基因的dsRNA至羽化后3日龄的成虫，在24 h后对照组、注射PBS组和注射dsRNA组成虫的CYP6G6的表达量相对于内参分别为0.63、0.24和0.13，马拉硫磷处理后各组对应的死亡率分别为28.4%、33.2%和39.6%，死亡率略有升高，但由于试验重复性不够稳定，各组间差异不显著。通过真核表达系统，CYP6G6在Sf9细胞中得到表达，但通过CO差光谱法检测只在420 nm处出现吸收峰，在450 nm处未检测到吸收峰；而对照组在420 nm和450 nm处均没有吸收峰。

目录

声明

第一章 文献综述

1 桔小实蝇的危害与防治

2 桔小实蝇抗性的发展和现状

3 桔小实蝇的抗性机理研究

4 组学在桔小实蝇抗性研究的应用

引言

1 研究背景及意义

2 研究思路及总体框架

第二章 桔小实蝇细胞色素P450基因的克隆与序列分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第三章 桔小实蝇细胞色素P450基因的表达模式解析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第四章 桔小实蝇细胞色素P450还原酶基因克隆与功能研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第五章 桔小实蝇马拉硫磷抗性和敏感品系转录组比较分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第六章 CYP6G6在桔小实蝇马拉硫磷抗性中的作用

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第七章 主要结论、创新点及研究展望

1 主要结论

2 创新点

3 展望

参考文献

在读期间发表论文及参研课题情况

发表论文目录

参研课题情况

致谢