家蚕裸蛹突变基因鉴定及突变机理研究

摘要

动物丝纤维是一种蛋白质类的生物多聚材料，由于它具有出色的生物学活性，已经被广泛应用于生物医学领域。在动物界众多的丝纤维中，蚕丝和蜘蛛丝是迄今为止最引人注目和研究得最透彻的两种丝纤维。其中，丝蛋白基因结构，丝蛋白的合成、组装、分泌、运输，丝腺的生长发育以及丝蛋白生物材料的应用，是丝纤维基础研究的热题，却也包含着众多的未知。本研究选取与家蚕丝蛋白合成相关的裸蛹（Naked Pupa，Nd）突变体作为研究对象，旨在阐明其突变机理，以丰富对丝蛋白合成分泌的认识。Nd突变由单基因控制，呈显性遗传，遗传连锁将其定位于第25号染色体0.0 cM位点，为家蚕第25号染色体经典的遗传标记。早期的研究报道 Nd突变体的突变表型为后部丝腺退化，茧层仅含丝胶，极薄，多数不能成茧。本研究通过表型观察、基因鉴定、通路解析和功能验证全面地解析了Nd突变的突变机理。主要研究结果如下： 1. Nd突变体的丝素蛋白分泌能力缺陷影响泌丝行为 泌丝行为调查发现，Nd突变体从蚁蚕孵化起便没有丝纤维分泌，直至上蔟才能分泌出少量丝胶，形成的丝胶茧薄且易破，不能抽出丝来。解剖观察五龄第3天的 Nd突变体丝腺与大造对比发现，Nd突变体后部丝腺严重退化，中部丝腺发育正常。暗示丝素蛋白分泌能力受阻而丝胶蛋白分泌能力完好。茧丝溶解分析发现， Nd突变体茧丝能够完全溶解于尿素溶液（常用于丝胶提取），而大造茧丝中有大量不溶丝状物，暗示Nd突变体茧丝中主要成分为丝胶。以上结果表明Nd突变体丝素蛋白分泌能力从始至终存在缺陷，其后部丝腺发育受到影响。 通过将上蔟期的Nd突变体幼虫置于不同的上蔟环境中（普通的塑料网格蔟和优异的纸板方格蔟），发现上蔟环境对 Nd突变体突变表型的稳定十分重要，在大小合适的纸板方格蔟中，所有的 Nd突变体均能结出丝胶茧，没有裸蛹表型出现。即优异的上蔟环境为Nd突变体的“丝胶茧”表型稳定的必要条件。 2. Nd突变体FibH R08-10区域突变导致形成C端缺失的FibH 基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的连锁定位分析，将突变基因锁定在第25号染色体nscaf2823上537 kb的区域内，该区域含有13个候选基因。表达模式分析发现仅编号为 BGIBMGA005111的基因呈现出差异表达模式，即该基因在Nd突变体后部丝腺中的表达量显著低于在大造后部丝腺中的表达量，并注释为丝素重链基因（fibroin heavy chain，FibH）。由此推测FibH为引起Nd突变的候选基因。测序分析发现Nd突变体FibH编码区的NTD与CTD序列没有变化，而NTD与CTD之间长达15 kb的编码区由于富含GC且高度重复难以扩增测序，因此我们在蛋白质水平检测了突变的发生。 FibH由家蚕后部丝腺特异性合成，通过对后部丝腺蛋白质提取物进行LC-MS检测，发现在Nd突变体中仅能检测到FibH NTD肽段，检测不到CTD肽段，在大造中则均能检测到。表明Nd突变体CTD部分发生缺失或移码突变。为了进一步验证检测结果，我们针对FibH设计并制备了对应不同区段（N端：NTD，非结晶区01：A01，非结晶区02-10：A02-10，C端：CTD）的抗体。免疫荧光结果显示在 Nd突变体中，FibH的荧光信号大部分在后部丝腺细胞中，仅有微弱部分在丝腺腔中（丝素蛋白残留），表明FibH分泌受阻。与大造对比发现，在Nd突变体后部丝腺细胞中FibH NTD、FibH A01均能检测到较强的信号，FibH A02-10信号强度骤减，FibH CTD完全无信号。根据以上结果，推测Nd突变体的FibH在A02-10区域发生突变，导致抗体结合靶位点减少，引起荧光强度骤减。Western blot分析发现Nd突变体FibH编码一个分子量比正常小的突变FibH（小于390 kDa，大于240 kDa），且能形成聚体。FibH序列分析发现，仅有A07之后的序列突变才能编码出分子量大于240 kDa的突变FibH。综上所述，Nd突变体中FibH A07-A10之间的区域（重复区R08-R10）发生突变，导致编码出C端缺失的截短FibH。 3.分泌受阻的突变FibH使丝腺细胞持续处于压力应激环境导致丝腺退化 为了阐明C端缺失的FibH与丝腺退化之间的关系，首先使用透射电镜对Nd突变体和大造后部丝腺亚细胞结构进行对比观察。结果显示Nd突变体后部丝腺细胞蛋白质囊泡运输及分泌系统受阻，细胞质中内质网扩张、高尔基体萎缩、有大量自噬体分布，后部丝腺腔中仅有一些丝素蛋白残留。Western blot检测发现 Nd突变体后部丝腺腔中的丝素蛋白残留不能被向前运输到中部丝腺。结果表明CTD对FibH有效分泌至关重要。 FibH为组成蚕丝的主要成分，是一个大分子结构蛋白，不参与具体的信号传导途径或分子通路。因此我们通过RNA-seq检测结构蛋白的突变引起的细胞通路变化。差异表达基因检测结果发现1,245个基因在Nd突变体后部丝腺中显著上调表达，924个基因在Nd突变体后部丝腺中显著下调表达。差异基因KEGG通路富集分析将Nd突变涉及的分子通路富集到神经退行性疾病（亨廷顿病、阿尔兹海默病和帕金森病）分子通路和细胞在应激条件下启动的细胞质量控制系统通路。这两类通路的共同点为：均可因错误折叠/组装的蛋白质在胞内发生聚集，导致分泌障碍。在Nd突变体中，C端缺失的FibH即为单个重复单元形成的大分子聚体蛋白，且分泌受阻。因此暗示Nd突变体后部丝腺细胞中C端缺失的FibH是激活这些分子通路的原因。 器官退行性变化的特点是随着时间推移愈发严重。我们检测了Nd突变体整个幼虫期丝腺的发育变化，并对RNA-seq鉴定到的细胞自噬、泛素蛋白酶系统和热激反应通路中的差异基因 ATG8/LC3、E3和HSP19.9进行检测。丝腺发育变化调查结果表明，Nd突变体后部丝腺细胞数与大造无差异，但随着幼虫生长，后部丝腺退化程度越来越严重，细胞核分枝状发育越来越不足，以至于五龄末期后部丝腺细胞核内总DNA含量仅为大造的3分之1。值得注意的是这些变化均是从四龄第1天开始以后迅速出现。荧光定量分析发现，四龄第1天是FibH高量表达的时期，意味着在 Nd突变体中 C端缺失的 FibH在细胞中的量增多，ATG8/LC3、E3和HSP19.9的检测结果显示它们在Nd突变体中显著上调表达。推测C端缺失FibH的大量出现激活了细胞自噬、泛素蛋白酶系统和热激反应等通路，随着幼虫的生长， Nd突变体后部丝腺细胞发育越来越受阻，退化表型也越来越明显。 4. CRISPR/dCas9系统与遗传杂交分析验证突变机理 利用CRISPR/dCas9转录激活系统，我们在细胞水平验证了FibH分泌障碍激活RNA-seq富集到的细胞应激反应通路。基于家蚕胚胎细胞（BmE）不表达FibH，且不具备FibH分泌条件，首先在FibH启动子区域设计3条靶位点sgRNA，再将它们与没有切割活性而融合激活因子的Cas9蛋白（dCas9-VPR）共转BmE细胞，荧光定量检测发现sgRNA-T1与dCas9-VPR以9:1的比例共转，且在转染后第60 h达到内源FibH被激活表达的最大值。检测60 h时间点ATG8/LC3、E3和HSP19.9的表达水平发现这3个基因在FibH激活的细胞中显著上调表达。溶酶体标记探针（Lyso-Tracker）与细胞自噬标记探针（monodansylcadaverine，MDC）染色发现在FibH激活的细胞中阳性染色细胞数显著高于对照。以上结果表明具有分泌障碍的FibH能够激活了细胞自噬、泛素蛋白酶系统和热激反应等细胞应激反应通路。 Nd突变体为后部丝腺退化的显性“丝胶茧”突变体（FibH突变），Nd-s突变体为后部丝腺退化的半显性“丝胶茧”突变体（FibL突变），fibH-k突变体为后部丝腺正常的隐性“丝胶茧”突变体（FibH突变）。正确的丝素小体结构是FibH高效分泌的必要条件，以上3类突变均由丝素小体结构异常导致。Nd突变与Nd-s突变形成具有分泌障碍的大分子高重复 FibH，导致丝腺退化；fibH-k突变形成仅含部分NTD的小分子FibH，分泌系统与丝腺发育正常。荧光定量检测发现，以上3种突变体FibH表达水平显著低于大造，但只有在后部丝腺退化的Nd突变体与Nd-s突变体中检测到ATG8/LC3、E3和HSP19.9的显著上调表达。暗示丝腺退化的发生与细胞应激反应通路的激活有关。 将上述3种突变体与正常大造杂交，发现Nd/+杂合体后部丝腺退化，fibH-k/+杂合体后部丝腺恢复到同大造一样，Nd-s/+杂合体后部丝腺介于二者之间。基因表达检测发现ATG8/LC3、E3和HSP19.9在后部丝腺退化的Nd/+杂合体后部丝腺中均上调表达，在表型有所恢复的Nd-s/+杂合体后部丝腺中仅E3和HSP19.9上调表达。研究结果显示后部丝腺细胞中应激反应越剧烈，丝腺退化越严重。 5. Nd突变体显性产生不含丝素蛋白的丝胶茧 对纯合的 Nd突变体、Nd-s突变体和 fibH-k突变体及其杂合后代的茧丝进行分析，发现纯合突变体的茧均很薄且易破，能在尿素溶液中完全溶解。而在杂合后代中，仅 Nd/+杂合体的茧能完全溶解，表明 Nd突变体具有显性产生丝胶茧的能力。Nd-s/+杂合体产生的茧中含有正常茧一半量的丝素成分。fibH-k/+杂合体产生的茧中丝素的量与正常茧无差异。Western blot分析发现Nd突变体和Nd-s突变体的茧中不含任何丝素蛋白组分（FibH、FibL和P25），fibH-k突变体的茧中虽然不含FibH，却含有FibL与P25。在杂合后代中，仅Nd/+杂合体的茧中不含任何丝素蛋白组分。以上结果表明仅Nd突变体及其杂交后代能产生不含任何丝素蛋白组分的丝胶茧。 利用Nd突变体产生的丝胶茧，比较3种提取方法对丝胶完整度的影响，发现LiSCN提取法可以获得结构完整的丝胶蛋白，尿素提取法使最大分子量丝胶发生降解，H2O提取法是所有丝胶条带均发生降解。凝胶制备实验发现仅LiSCN法提取的丝胶蛋白可以通过构象改变而非化学/物理交联形成有弹性的凝胶。结果表明利用丝胶茧以及LiSCN提取法可以获得结构完整的丝胶蛋白。 利用Nd突变体显性产生丝胶茧的能力，能通过将其与不同茧质的生产用种或丝胶启动子表达外源蛋白的转基因品种杂交，获得结构功能多样丝胶茧，便于对丝胶的研究和拓展丝胶材料在生物医药领域的应用。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1概述

1.2动物丝的生物学意义

1.3家蚕丝腺的发育与丝蛋白合成

1.4丝相关突变体的研究

1.5丝胶材料的应用

第二章 引 言

2.1研究背景

2.2研究目的和意义

2.3科学问题和主要内容

2.4技术路线

第三章 裸蛹突变体泌丝行为调查与突变基因鉴定

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3结论与讨论

第四章 丝素分泌障碍与丝腺进行性退化的分子机理解析

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.3结论与讨论

第五章 丝素缺陷型突变体茧丝中丝素成分分析

5.1材料与方法

5.2结果与分析

5.3结论与讨论

第六章 综合与结论

论文的创新点

参考文献

附录

发表论文及参研课题情况

致谢