MSCs复合基因修饰型溶胶凝胶微纳米生物活性玻璃修复牙槽骨缺损的实验研究

摘要

目的： 1.构建骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)基因修饰型溶胶凝胶微纳米生物活性玻璃（micro-nanoscale bioactive glass，MNBG）支架（BMP-2/MNBG支架）。 2.构建骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作为种子细胞、BMP-2作为细胞因子、MNBG作为支架材料的新型组织工程骨（MSCs/BMP-2/MNBG支架）。 3.考察MSCs在支架上的粘附、增殖、分化等行为，体外评价该支架材料的生物相容性。 4.考察MNBG支架、BMP-2/MNBG支架、MSCs/BMP-2/MNBG支架对恒河猴牙槽骨缺损的修复效果，体内评价其成骨性能，并探讨其骨修复作用机制。 方法： 1.构建携带BMP-2基因的质粒，与壳聚糖复合，得到载BMP-2基因壳聚糖纳米粒，将其与华南理工大学提供的MNBG支架复合，得到BMP-2/MNBG支架。 2.选取6岁、3-5 kg的健康雌性恒河猴，穿刺抽取髂骨骨髓，采用密度梯度离心法分离MSCs，倒置相差显微镜下观察细胞的生物学特性，用成骨诱导培养基对其进行诱导分化，通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色检测MSCs向成骨细胞分化的能力。 3.取诱导为成骨细胞的自体MSCs，与基因修饰型微纳米生物活性玻璃支架进行体外复合培养，通过MTT检测细胞在支架上的的粘附、增殖行为，评价该支架材料的生物相容性，通过测定支架上MSCs的ALP活性来检测其在支架材料上的成骨性能。Western blot实验检测BMP-2的表达。 4.选取10-12岁、5-7 kg的雌性恒河猴4只。拔除上下颌双侧尖牙、第一、二前磨牙区牙齿，建立16个约10×7×5 mm的牙槽骨缺损区，上颌右侧缺损区植入MSCs/BMP-2/MNBG支架（A组），上颌左侧缺损区植入BMP-2/MNBG支架（B组），下颌右侧缺损区植入MNBG支架(C组)，下颌左侧缺损区作为空白对照不植入任何材料(D组)。分别于植入材料后3个月、6个月、9个月行大体、X线检测、Micro-CT+三维重建以及组织学观察。 结果： 1.溶胶凝胶微纳米生物活性玻璃促进了MSCs及成骨细胞粘附、增殖和分化，对恒河猴牙槽骨缺损有明显的组织修复再生作用，无不良反应，该材料降解速度是与新生骨组织的产生长入速度基本相匹配，并最终完全降解吸收被新生的骨组织代替。 2. MSCs取材方便，性状稳定，传代扩增培养方便，成骨诱导条件培养基下可成功向成骨细胞分化。 3. BMP-2促进MSCs的增殖，诱导其向成骨细胞分化，分化为成骨细胞后又进一步增加了BMP-2的表达，加强了骨修复作用。 4.构建的新型组织工程骨MSCs/BMP-2/MNBG支架植入恒河猴牙槽骨缺损区实验中，大体、X-ray及Micro-CT观察显示新生骨量、密度、硬度、结构与正常骨极为接近，骨皮质光滑与周边正常骨连接紧密。组织学观察显示缺损区炎症反应小，材料全部吸收，新生成骨细胞活跃，新生组织结果接近正常骨，有效促进恒河猴自体牙周支持骨缺损的修复。 结论： 1.溶胶凝胶微纳米生物活性玻璃具有良好的生物相容性和成骨性能，可作为新型骨组织工程用支架材料。 2. BMP-2基因以壳聚糖纳米粒的形式复合到支架上，亦可以发挥诱导成骨作用，可作为构建组织工程骨的细胞因子。 3. MSCs在体外培养中被诱导分化为成骨细胞，MSCs诱导后可较好地在溶胶凝胶微纳米生物活性玻璃支架上生长增殖，并促进了成骨修复，骨髓间充质细胞具有很强的成骨潜力，是较为理想的骨再生种子细胞。 4. MSCs细胞与BMP-2生长因子在相互作用促进骨缺损修复产生新生骨的同时，实验用材料在体内逐渐降解，实验观察到材料降解速度是与新生骨组织的产生长入速度基本相匹配，故植入的材料基本不会对MSCs调控新生骨的产生起到阻碍作用。 5.本论文构建的新型组织工程骨MSCs/BMP-2/MNBG支架对恒河猴牙槽骨缺损具有较好的修复作用，有望为口腔临床治疗牙周支持组织丧失提供新的途径。

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1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3. 结果

3.1 恒河猴骨髓MSCs培养及诱导

3.2 壳聚糖纳米颗粒与pcDNA3.1（+）-BMP2 结合凝胶阻滞分析

3.3 细胞复合支架MTT检测结果

3.4 Western blot检测

3.5 材料植入实验动物后临床观察及大体观察

3.6 X-ray观察

3.7 Micro-CT扫描重建

3.8 Micro-CT新生骨密度分析

3.9 组织学观察

4 讨论

5. 小结

参考文献

综述:微纳米生物活性材料在骨修复的应用

致谢

附录一： 缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况