大鼠出生后听皮层神经元电生理特性的发育变化及听觉丘脑-皮层脑片突触传递的研究

摘要

动物出生后2-4周，听觉通路的各个部分及彼此之间的神经纤维联系逐渐发育成熟并构成一个完整的神经回路。位于丘脑的内侧膝状体(medialgeniculatebody，MGB)是特异的听觉中继站，其神经元发出的上行性纤维呈扇形经内囊投射至初级听皮层(primararyauditorycortex，A1，Te1)及其它听觉皮层的相应区域，其中始于内侧膝状体腹侧部(theventralpartionofmedialgeniculatebody，MGBv)的听觉丘脑皮层上行通路称为初级听觉丘脑皮层通路，主要介导对声刺激的短潜伏期反应以及运载关于刺激频率、强度和时程的精确信息，并且影响初级听皮层神经元对输入信息的处理及反应形式，在听觉系统中起着非常重要的作用。 随着膜片钳技术的不断成熟，不仅可在传统的冠状或是矢状位的脑片切片上分别研究MGB或初级听皮层神经元的电生理特性的发育变化，而且根据对大鼠听觉丘脑一皮层投射纤维的稳定走行的长期解剖学方面的研究结果，通过改换脑片切片时的角度可以在离体脑片上保存好MGBv与初级听皮层(primararyauditorycortex，A1)以及二者之间的较完整的纤维联系，从而使得在脑片上对更大范围的听觉神经元间突触传递机制的研究成为可行，并且可以在脑片上极其便利的了解A1神经元对传入信息所发生的突触后反应及其细胞机制。 为此，本课题采用脑片膜片钳技术和方法，对出生后P3-30d的大鼠A1神经元的电生理及形态学特性的发育变化进行较系统的了解，以及在听觉丘脑皮层脑片上研究刺激MGB或听觉丘脑-皮层通路诱发的A1神经元突触后电生理学反应的形式及特点。 第一部分：采用脑片膜片钳全细胞记录技术，研究出生后不同发育阶段大鼠的A1神经元膜学特性、电压依赖性离子通道变化，及biocytin细胞内染色，结果显示如下：1.P3-11d(postnatalday，出生后)，不同天龄A1神经元的RMP(restingmembranepotential)、Ri(inputresistance)和Tau(timeconstant)的差异非常显著，P12d后基本不再发生变化。在P3-12d的发育期，膜电位从-40mV超极化至-68mV。静息膜电位的超极化可能与Na+/K+泵活性增强以及K+电流的增加或cl-翻转电位的降低有关。随着膜面积的延伸，离子通道密度相应增加可解释在发育过程中输入阻抗的降低。 2.不同天龄A1神经元动作电位幅度和时程在P3-11d差异显著，之后基本不再发生变化。 3.在A1神经元发育过程中，其电压依赖性离子通道的变化影响了出生后大鼠A1神经元动作电位的形态。电流钳记录方式下，10μmol/L的K+通道阻断剂4-AP使P8d大鼠听皮层神经元动作电位幅度降低，时程变宽，动作电位的数目减少，使P13d大鼠听皮层神经元动作电位逐渐降低至脉冲终末达到平台电位，说明电压依赖性K+在出生后大鼠听皮层神经元上还未发育成熟。300nmol/L的Na+通道阻断剂TTX对P8d和P13d大鼠听皮层神经元动作电位的作用基本相似，使动作电位的发放减弱或消失，仅见LTS，表明Na+通道在出生后发育已较成熟。50μmol/L的Ca2+通道阻断剂CdCl2引起P8d的听皮层神经元动作电位的发放逐渐减弱，在脉冲终末达到平台电位，而仅使P13d的听皮层神经元动作电位的幅度降低，时程延长，表明Ca2+对听皮层幼稚神经元动作电位的维持发挥了重要的作用。 4.采用脑片膜片钳全细胞记录和细胞内染色相结合的技术，观察大鼠出生后不同发育阶段的A1神经元形态的变化。Biocytin组化染色结果表明，随着出生后天龄的增长，A1神经元胞体逐渐呈锥形、短梭形或长梭形，轴突出现较早，轴突自胞体或主树突近胞体处发出，树突发育相对较晚，但随着出生后天龄的增长其变化更为明显，表现为树突增粗增长，分支增多，树突野范围增大，并出现树突棘。听皮层超微结构显示，P3-30d神经毡面积逐渐增大，胶质细胞逐渐增多，高尔基器等神经元细胞器发达。这些结果说明，大鼠听皮层及其神经元形态在出生后尚未发育成熟，需经过一定时间才能达到成年水平。 第二部分：改换脑片切片的角度，使脑片包含有部分MGBv和A1神经元及其之间较完整的丘脑皮层神经纤维突触联系，通过biocytin细胞外染色以及刺激MGBv神经元或丘脑-皮层投射纤维引出皮层神经元的突触后反应证明听觉丘脑皮层通路的存在，观察A1神经元突触后电活动反应形式及特点，了解突触传递在A1神经元对传入信息的整合及处理中的作用机制。结果如下：1.听觉丘脑-皮层脑片制备由于初级听觉丘脑皮层通路和次级听觉丘脑皮层通路相互交叉或重叠，尽管它们的功能不同，但是目前的丘脑皮层脑片还无法将它们分别独立出来进行研究。听觉丘脑-皮层通路在走行上有几个转折点，所以使得400μm厚的脑片往往不能包含一个较完整的丘脑-皮层系统，刺激MG时，较少能引起皮层的反应，仅在刺激丘脑-皮层通路中的上丘辐射部分时可以引出皮层反应。为了获得较为完整的丘脑-皮层通路，将切片的厚度由400μm调整至600μm后可以获得含有完整丘脑-皮层通路的脑片，刺激MG均可记录到清晰的，短潜伏期的皮层反应。 2.早和晚的突触后电流将记录电极置于听皮层的第Ⅱ-Ⅳ层，通过在亚皮层刺激位点给予幅度0.5mA，时程100μs的刺激可以在A1细胞诱导出含有早和晚反应成分的突触后电流(postsynapticcurrents，PSCs)。突触后电流在细胞膜去极化时幅度减小，而超极化时增大。选择性的应用谷氨酸盐受体拮抗剂证明谷氨酸盐受体在突触后电流产生中的作用。NMDA受体拮抗剂APV(25-50μM)可使早电流成分稍减小，但是可完全阻断晚电流成分。AMPA/KA受体拮抗剂CNQX(20μM)也可阻断晚电流成分，而早电流成分逐渐减小，约持续3-10min左右，残余的早电流成分可被APV完全阻断，可见突触后电流的早反应成份含有AMPA/KA和NMDA受体共同介导的成分。

目录

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主要英文缩略词表

前 言

第一部分大鼠发育过程中听皮层神经元的电生理学特性及形态学特征

材料和方法

结 果

讨论

小 结

第二部分听觉丘脑-皮层脑片的制备及离体突触传递机制的研究

材料和方法

结 果

讨论

小 结

全文结论

致 谢

参考文献

文献综述 快蛋白——耳蜗外毛细胞的一种新型马达蛋白

研究生期间发表的文章