重庆市水环境中抗生素污染与微生物抗生素耐药性研究

摘要

随着人畜药物使用量的剧增和环境分析测试技术的快速发展，水环境中药物污染研究近年在德国、丹麦、瑞士和美国等发达国家受到了前所未有的关注。现有研究表明：多数药物在人和动物机体内都不能够被完全代谢，多以原形和活性代谢产物的形式通过粪便排到体外。这些物质最终会通过医院污水、城市生活污水、牲畜粪便及医药工业废水等多种途径进入水环境造成污染。在水环境的药物污染中，抗生素污染是显得格外重要的一类。医药行业为牟取暴利而不合理使用抗生素、畜牧水产养殖业为增产而大量使用抗生素的现象使得抗生素对生态环境的负面作用正逐渐显现。德国、瑞士、丹麦和美国等国先后有人报道在医院污水、污水处理厂污水和活性污泥、水产养殖厂水体和底泥、地表水和地下水等水体中检出多类不同浓度的抗生素。水环境抗生素污染最有可能产生的效应是其持续低水平的暴露对水生生物的远期毒性作用和对其微生物群落产生的抗生素耐药性选择压力，后者与人类健康的关系更为密切。水环境微生物耐药性卫生学意义重大：耐药微生物及耐药因子可经多途径侵入机体，将耐药性传递给体内致病菌，加大感染性疾病的治疗难度；抗生素耐药谱分析(antibioticresistantanalysis，ARA)是近年发展并得到应用的水污染的微生物源追踪(microbialsourcetracking，MST)技术的主要研究方法之一。 本课题第一部分以地处三峡库区的重庆市水环境为研究对象，对水环境中的抗生素污染进行初步探索，为今后的深入研究和动态监测提供基础。第二部分以耐热性大肠菌群(亦称为粪大肠菌群)为指示菌，对重庆市多种水体中微生物对十种常用抗生素的耐药性进行了初步调查研究，并为在重庆市以ARA为手段进行MST研究提供了线索。第三部分对所有分离的耐热性大肠菌群的质粒谱进行分析，对菌株的多重耐药性决定因子进行初步定位。 实验方法：采集水样：采集唐家桥污水处理厂进水、一级处理污水和二级处理污水，西南医院、324医院、肿瘤医院和新桥医院污水处理站出水，沙坪坝水厂、渝中区水厂、江南水厂、和尚山水厂和西南制药厂水厂水源水，屠宰场下游地表水和畜禽养殖厂下游地表水水样。确定受试抗生素为：氧四环素(Oxytetracycline)、四环素(Tetracycline)和氯四环素(Chlortetracycline)。固相萃取(SPE，solidphaseextraction)：经预处理的SAX(500mg/6ml)和HLB(500mg/6ml)固相萃取小柱串联过水样，后者用柠檬酸缓冲液和冲洗后在氮气流下吹干，甲醇洗脱。洗脱液经氮气吹干后用100μl流动相A定容，-20℃储存备测。用HPLC/MS对各水样中经SPE所得富集产物中的四环素进行分析测试。色谱柱为PhenonomenexLunaC18(150×3.0mm,3μm)。以流动相A(含10mM甲酸铵、0.3％甲酸和10％甲醇的水溶液)和流动相B(含10mM甲酸铵、1.0％甲酸的甲醇溶液)进行梯度洗脱，分离受试化合物。离子化采用电喷雾阳离子模式(ESI(+))，监测方法为选择性离子监测(SIM)。四环素的鉴定以保留时间、定量离子与确认离子(1或2种)的比值为依据，其定量通过分析物与内标物(Simatone)的基峰离子面积比值来计算。 以耐热性大肠菌群作为指示菌分析重庆市水环境中微生物对人畜常用十种抗生素的耐药性并小量制备质粒DNA进行质粒谱分析。采集的水样有：受医院污水污染地表水样，屠宰场下游与畜禽养殖场下游地表水样，污水处理厂进水与出水、嘉陵江地表水，歌乐山山顶泉水。富集分离并鉴定菌株：用经美国国家环保局认证的滤膜法对各水样中耐热性大肠菌群进行富集分离，并用APILabPlus微生物分析系统进行菌种鉴定。抗生素敏感性试验：采用美国临床实验室标准委员会(NCCLS1997版)推荐的Kirby-Bauer琼脂扩散法，选择人畜最常用的青霉素、氨苄青霉素、头孢他啶、庆大霉素、丁胺卡那霉素、红霉素、链霉素、环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星等10种抗生素进行药物敏感性试验。分析菌株质粒谱：用碱裂解法小量制备各分离菌株的质粒DNA，经0.7％琼脂糖凝胶电泳后用Quantityone系统估算其大小，分析菌株质粒谱。 实验结果：1.从重庆市5种水体的14个水样中检出浓度为0.015～0.214μg/L的氯四环素、氧四环素和四环素。其中有8个水样至少检测到1种四环素，检出最多的是测到3种四环素的污水处理厂进水。 2.从7种不同水体分离得到的162株耐热大肠杆菌中156株(96.3％)为埃希氏大肠杆菌，5株为克雷伯氏菌，1株为亚利桑那沙门氏菌，埃希氏大肠杆菌为优势菌。除3株分离自山泉水的菌仅对青霉素和红霉素两种抗生素耐药外，其它菌株都对3种及3种以上抗生素耐药，多重耐药率达到98.1％，对所选十种抗生素都耐受的菌为15株(9.3％)。十种抗生素耐药率依次为：青霉素100％，红霉素99.4％，链霉素85.2％，氧氟沙星74.5％，环丙沙星56.8％，诺氟沙星56.2％，庆大霉素47.5％，头孢他啶42.0％，氨苄青霉素33.3％，丁胺卡那霉素22.2％。不同水体分离菌株对氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、丁胺卡那霉素、链霉素等5种抗生素的耐药率有显著性的差异(P＜0.005)。不同水体的分离株耐药率两两比较发现：除嘉陵江地表水和屠宰场、畜禽养殖场下游地表水外，其它不同水体间微生物对1～5种抗生素的耐药率具有显著性差异(P＜0.01250)。污水处理厂进水和出水分离菌株的抗生素耐药率无显著性差异(P＞0.01250)。 3.162株分离菌株中有92株(56.8％)提取到大小为0.90～158.83Kb、数量为1～6个的质粒，有81种质粒谱型。70株(43.2％)未提取到质粒的细菌中对2种抗生素耐受的有3株，其余67株均对3种及3种以上抗生素耐受(多重耐药)；具有相同质粒谱型的菌株耐药谱都不相同；未发现质粒数量的多少与抗生素耐受种类多少间有明显相关性。 结论与展望：1.SPE与HPLC/MS适于对重庆市水环境中抗生素污染进行动态监测。2.重庆市多种水体中普遍存在痕量水平的四环素类抗生素，应进行周密布点，选择出具代表性的抗生素，对重庆市水环境中抗生素污染进行长期监测。3.重庆市水环境中微生物的抗生素耐药性已普遍存在，形成原因有待深入研究。4.不同水体分离的耐热性大肠菌群对氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、丁胺卡那霉素和链霉素的耐药性有显著性差异，可以这五种抗生素为代表进一步研究重庆地区耐热大肠菌群各宿主(如人、各种家禽家畜)粪便及各种水体中耐热性大肠菌群的抗生素耐药性并建立相应数据库，为以ARA进行微生物污染源追踪的可行性研究奠定基础。5.在重庆市医院污水、污水处理厂出水和嘉陵江地表水的水质监测项目中加入微生物耐药性指标具有重要意义。6.未发现耐热性大肠菌群质粒谱与耐药谱间有明显相关性，推测菌株多重耐药性可能不是质粒DNA介导；各菌株质粒谱具有高多态型，质粒谱分析不能用于区分重庆市水环境中微生物污染来源。

目录

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英文缩写与中文对照

摘要

前言

第一部分 重庆市水环境抗生素污染研究

第二部分 重庆市水环境微生物耐药性研究

第三部分 重庆市水环境微生物质粒谱分析

全文总结

致谢

照片

参考文献

文献综述 水中抗生素污染现状及检测技术研究进展

在读期间发表及完成的论文