抗幽门螺杆菌UreB及HpaA抗原单抗的制备及临床应用探索

摘要

目的：幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是一种定植于胃内的革兰氏染色阴性、螺杆状、微需氧菌，目前全球近50％的人口感染了Hp，在发展中国家，其感染率可达到70％以上。因此，建立无创、便捷、廉价的检测方法对Hp的早期诊断具有重要的应用价值。目前，Hp的诊断方法主要有侵入性和非侵入性，非侵入性因为良好的病人依从性而倍受青睐。而非侵入性方法中，血清学实验在年轻患者中准确性不高，而13C尿素呼吸实验很昂贵，因而有必要寻找一种准确性高、无创、简便、价廉的诊断Hp感染的新方法。由于Hp是经粪-口传播，因此，以ELISA方法检测粪便中Hp抗原(HpyloristoolantigenEIA，HpSA)就成为可能。自从1998年HpSA检测被FDA批准在临床应用后该方法就在世界各国被评价，平均敏感性和特异性可达到90-98％，HpSA检测是一种廉价、实用的方法，不仅适用于治疗前和治疗后的诊断，而且对于各年龄段的儿童准确性均很高。 Hp尿素酶B亚单位(ureaseBunit,UreB)和Hp粘附素A亚单位(HelicobacterpyloriadhesinAunit,HpaA)均是位于Hp菌体表面的蛋白，在Hp各菌株中甚至球形体中都保守存在，其中UreB含量较高，占菌体总蛋白2.5-5％，而HpaA蛋白特异性较好，本研究拟通过制备抗Hp尿素酶B亚单位蛋白和鞭毛粘附素蛋白A蛋白的单克隆抗体，对抗体特性进行鉴定，建立夹心ELISA检测体系，对人粪便样本进行检测，为Hp临床诊断奠定基础。 方法： 1.抗UreB和抗HpaA单克隆抗体的制备采用杂交瘤技术制备抗UreB和HpaA单克隆抗体，对比硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法、蛋白A柱亲和层析法三种纯化方法对单抗亲和力的影响，从而确定最佳纯化方案。 2.抗UreB和抗HpaA单克隆抗体特性的鉴定以非竞争ELISA法测定单抗的亲和常数；以ELISA相加实验初步确定单抗识别的表位；以间接荧光法分析单抗与Hp表面蛋白结合特性，以Westernblot鉴定单抗与重组蛋白、Hp标准菌株、Hp临床分离株、Hp球形体的反应性，与肠致病性大肠杆菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、克雷白氏产气杆菌等肠道常见菌的特异性。 3.夹心ELISA法的建立制备兔抗Hp多克隆抗体，建立(1)抗HpaA单抗包被、多抗夹心(2)抗UreB单抗包被、多抗夹心(3)抗UreB和HpaA单抗以10μg/ml，5μg/ml混合包被、多抗夹心等三种检测系统，摸索了最适单抗包被量，最适夹心抗体量，最适封闭液及封闭时间，鉴定ELISA系统对Hp标准菌株及四种肠道常见菌的反应特异性，测定各ELISA系统的最低检出限。 4.粪便样本的检测对经13C确诊的10份正常人粪便标本和6份Hp阳性患者粪便样本进行检测，以阴性标本的cut-off值为阳性判断标准。 结果： 1.制备了3株抗HpaA单抗，HpaA-2C6、HpaA-A2、HpaA-2B3；4株抗UreB单抗，UreB-6E6、UreB-1D6、UreB-1D5、UreB-9E1。对比三种抗体纯化方法的优劣，结果表明，硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法、蛋白A柱亲和层析法UVP扫描抗体纯度分别为80％、94％、97％，但硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法纯化得到的抗体相对亲和力高于蛋白A柱亲和层析法，因此选择辛酸-硫酸铵法作为抗体纯化方法。 2.间接免疫荧光法直接证明6E6和2C6能与Hp表面蛋白结合，westernblot证明7株单抗均与重组蛋白、Hp标准菌株、Hp临床分离株、Hp球形体发生特异性反应，与肠致病性大肠杆菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、克雷白氏产气杆菌无交叉反应。7株单抗的亲和常数在107-109之间，其中单抗HpaA-2C6和UreB-6E6亲和常数为4.660×108，3.036×109，由于具有相对高的亲和力做为ELISA检测系统的候选抗体。 3.ELISA检测系统的最适封闭液和封闭条件为10％FCS，37℃孵育2小时，而后4℃过夜。HpaA系统和UreB系统均能与Hp全菌发生特异性反应，与其它四种肠道常见菌无特异性反应。HpaA系统最低检出限为10.3μg/ml，UreB系统的最低检出限为0.35μg/ml，HpaA和UreB单抗以5μg/ml、10μg/ml包被系统的最低检出限为0.18μg/ml。 4.三种ELISA检测系统中，UreB组的cut-off值为0.166，HpaA组的cut-off值为0.376，UreB和HpaA混合组的cut-off值为0.176。10例阴性样本和6例阳性样本中，UreB组和混合组有无假阴性、假阳性结果。而HpaA组出现三例假阴性，无假阳性结果。 结论： 1.通过杂交瘤技术成功制备了抗UreB和抗HpaA单抗，确定了纯化单抗的最佳方案。 2.对7株单抗的特性进行了鉴定，发现均具有较高的特异性，单抗HpaA-2C6和UreB-6E6由于具有较高亲和常数而作为ELISA检测系统的候选抗体。这些抗体在基因重组蛋白的纯化、Hp致病机理的基础性研究以及鼠源性抗体治疗研究等方面可能具有重要的应用价值。 3.初步建立了三种ELISA检测系统，并确定了最适反应条件，经试验证明ELISA检测系统具有较高的反应特异性。 4.对比三种ELISA检测系统对粪便样本检测结果，证明ELISA系统能检测到粪便中的Hp抗原，并推断出UreB和HpaA混合组，更适合临床应用。

目录

第三军医大学研究生学位论文独创性声明及第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书

英文缩略表

摘要

前言

第一部分抗幽门螺杆菌UreB及HpaA单克隆抗体的研制

第二部分抗rUreB和rHpaA单克隆抗体的特性研究

第三部分抗UreB和HpaA单克隆抗体临床应用初探

全文总结

参考文献

致谢

文献综述Hp感染的临床非侵入性诊断方法评价及研究进展

在读期间撰写发表的文章