皮肤创伤修复过程中P物质对表皮干细胞募集、分化的调控作用

摘要

皮肤创伤愈合是一个异常复杂的过程，有多种修复细胞、炎症细胞及细胞因子参与。这些细胞和细胞因子之间有着复杂的调控关系。它涉及细胞运动、粘附、通讯、增殖和分化等细胞生物学的多个方面。然而创伤愈合又是一个十分有序的过程，在机体精确的调控下，修复过程有条不紊的进行。近年研究表明，多种干细胞对创伤的修复起到关键的作用，特别是表皮干细胞被认为是皮肤及其附属器修复的源泉细胞。因此，阐明其分化、迁移的调控机制是实现创面完美愈合的关键，也是表皮干细胞走向临床的关键。 过去研究发现，感觉神经末梢分泌的感觉神经肽类物质(如P物质、CGRP等)可以促进伤口愈合，其机制可能和启动神经源性炎症反应、调控免疫细胞功能、促使修复细胞增殖等有关。前期实验发现，在正常皮肤伤口愈合过程中，外源性神经肽P物质(substanceP，SP)可以促进大量表皮干细胞募集于的创缘及肉芽组织中，加速伤口愈合。在此基础上，为进一步验证P物质促进表皮干细胞向肉芽组织中募集这一重要发现，本研究首先利用β1整合素、K19、K15等干细胞标记物以及干细胞慢周期性的特点(Brdu标记)，分别在体观察了正常皮肤伤口愈合过程中SP组(伤口给予外源性SP)、辣椒素组(采用特异性感觉神经毒性药物辣椒素(capsaicin)皮下预注射化学性除去感觉神经从而阻止神经肽分泌)、对照组肉芽组织中表皮干细胞分布特点；其次，糖尿病患者皮肤存在周围末梢神经的损伤和神经肽含量的下降，这是否会导致糖尿病皮肤伤口创缘表皮干细胞募集不足，继发伤口难愈?为验证此猜想，我们在糖尿病大鼠——这一“先天性皮肤感觉神经肽匮乏”模型上先观察了糖尿病大鼠患病不同时期皮肤基底层表皮干细胞变化趋势；继而在糖尿病大鼠难愈伤口模型上观察了外源性SP对表皮干细胞募集、迁移的诱导作用。 为深入研究P物质和表皮干细胞分化的关系，本实验首先在体外成功培养表皮干细胞，在此基础上利用免疫细胞化学技术和RT-PCR技术，分别从蛋白和mRNA两个水平检测离体培养表皮干细胞上是否存在SP特异性受体(NK-1R,NK-2R)及其mRNA表达；之后在细胞培养过程中加入SP和不同受体阻断剂，利用α6整合素和CD71两种标记物作为ESCs、TAC、PM-D的鉴定标准，并结合流式细胞仪进行鉴定分群和细胞比例分析，观察SP对培养表皮干细胞分化的影响。 结果显示：正常皮肤伤口愈合过程中只在SP组各时相点肉芽组织中发现了Brdu、K19、K15及β1整合素标记阳性细胞，而辣椒素组和对照组均未发现。在糖尿病鼠模型上，患病大鼠表皮厚度随着患病时间的延长而逐渐变薄，和对照组相比在患病后3周开始出现显著差异，5周左右至最低点。具有相同的趋势，基底层标记阳性细胞率在患病后2周也开始减少，至患病后6～7周降至最低点。在糖尿病鼠难愈伤口模型上，外源性SP能显著加速伤口愈合。同时，随着伤口的逐渐愈合，创缘及新生上皮中标记阳性细胞数量均有所增加，但SP组较对照组增加更为显著。激光共聚焦显微镜观察及RT-PCR结果显示，在离体培养的表皮干细胞中检测到了NK-1R和NK-2R抗原存在及mRNA的表达。在加入刺激剂培养96小时后，通过流式细胞仪检测到SP组(培养基中加入SP)中89.7％的细胞分化为TAC细胞(特征为整合素α6和CD71均为高表达)；NK-1R阻断组(培养基中加入SP和NK-1R阻断剂)有70.7％的细胞分化为TAC细胞。NK-2R阻断组(培养基中加入SP和NK-2R阻断剂)中可见60.1％的细胞仍然为表皮干细胞(特征为整合素α6高表达而CD71低表达)，30.7％的细胞分化为TAC，只有9.2％的细胞分化为PM-D细胞(特征为整合素α6低表达)。 研究结果提示：①正常皮肤创伤愈合过程中，SP可以促进表皮干细胞向创缘、肉芽组织中募集，从而加速伤口愈合；②糖尿病大鼠皮肤随着患病时间延长逐渐变薄，基底层表皮干细胞数逐渐减少。即糖尿病鼠皮肤中表皮干细胞库“干涸”可能是糖尿病皮肤菲薄、伤口难愈的机理之一；③糖尿病鼠皮肤伤口愈合过程中，SP可以明显促进表皮干细胞向创缘、肉芽组织中募集从而加速糖尿病伤口愈合；④表皮干细胞存在P物质特异性受体NK-1R/NK-2R(表达NK-1RmRNA和NK-2RmRNA)，说明存在P物质作用的物质基础；⑤SP可以促进表皮干细胞分化为短暂扩增细胞，这种促分化作用主要是通过NK-2R介导的。 综上所述，SP是调控表皮干细胞迁移、分化的重要因子。这一研究丰富了表皮干细胞分子生物学调控理论。

目录

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英文缩写一览表

第一部分在体实验：皮肤创面愈合过程中P物质对表皮干细胞募集的调控作用

实验一正常皮肤创面修复过程中P物质对表皮干细胞募集的调控作用

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

实验二糖尿病难愈创面修复过程中P物质对表皮干细胞募集的调控作用

Ⅰ表皮干细胞在不同时期糖尿病大鼠皮肤中分布的规律

Ⅱ糖尿病鼠难愈创面修复过程中P物质对表皮干细胞募集的调控作用

第二部分离体实验：P物质对表皮干细胞分化的调控作用

实验一表皮干细胞的体外培养

材料和方法

结 果

讨 论

结论

实验二表皮干细胞NK-1R和NK-2R的表达

材料和方法

结 果

讨论

结论

实验三P物质特异性受体在表皮干细胞分化中的作用

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

全文结论

致 谢

照 片1

照 片2

照 片3

参考文献

文献综述感觉神经肽与表皮干细胞在皮肤创面愈合过程中的作用及关系

研究生在读期间发表论文