气道粘蛋白大分子末端唾液酸化对粘蛋白-铜绿假单胞菌相互作用的影响及其机制

摘要

目的： 气道急性和慢性炎症过程中粘液及粘蛋白高分泌，糖基化程度也显著增加。唾液酸作为主要的末端糖基之一，也是多种细菌可结合的糖受体，其增多与感染严重程度密切相关。而COPD等气道慢性炎症还存在着分泌细胞增生肥大等可能易于发生高分泌及高度唾液酸化的病理学基础。这些改变的意义值得深入研究。本课题拟：(1)比较COPD与肺炎患者气道粘蛋白大分子末端唾液酸化的差异；(2)体外干预其末端唾液酸，观察对粘蛋白-铜绿假单胞菌相互作用的影响及两组标本相应变化的异同；(3)比较无明显感染的COPD和肺功能正常的对照组患者支气管粘膜中常见唾液酸转移酶mRNA表达水平的差异性；(4)体内应用相关干预因素，观察对盐酸致伤大鼠气管内接种细菌的影响。旨在探讨糖类抗细菌粘附剂的抗感染作用效果及机制，为进一步的药物研发提供实验依据。 方法： 1、收集24例COPD和无COPD及其他慢性呼吸系统疾病的肺炎患者(以下分别简称COPD组和肺炎组)气管插管或切开后的气道吸引物，用分次离心和琼脂糖CL-2B凝胶层析的方法分离纯化粘蛋白大分子；琼脂糖凝胶电泳及免疫印迹验证分离效果，试剂盒测定总唾液酸含量，凝集素ELLA法分别比较唾液酸α2,3-和α2,6-结构含量； 2、粘蛋白样品包被在硅化膜片上，分别用弱碱+硼氢化钠做β-消去、特异性植物凝集素Maackiaamurensisagglutinin(MAA)和Sambucusnigraagglutinin(SNA)、α2,3-特异性唾液酸酶和非特异性唾液酸酶处理，然后接种铜绿假单胞菌，或者是唾液酸双糖NeuAcα2-3Gal和NeuAcα2-6Gal分别与细菌混合接种，30min后解离细菌，定量培养以测定对细菌粘附的抑制作用；LB液体培养基中分别加入唾液酸双糖、特异性凝集素，以及α2,3-特异性唾液酸酶和非特异性唾液酸酶，混入菌液后加到粘蛋白包被的膜片上，7d后扫描电镜判断细菌生物被膜是否形成，解离细菌、定量培养测定膜片上的活菌数，以分析各种因素的抑制作用； 3、合并COPD或肺功能正常的肺癌患者新鲜手术切除标本24例，取远离肿瘤部位的亚段以上支气管粘膜，用RT-PCR方法检测4种粘蛋白常见唾液酸转移酶的mRNA，通过与内参GAPDH比较，获得其表达水平的差异性； 4、140只Wistar大鼠共分14组，每组10只，气管内滴入盐酸致伤，分别接种含PBS、唾液酸双糖(NeuAcα2-3Gal、NeuAcα2-6Gal)、特异性植物凝集素(MAA、SNA)及唾液酸酶(特异性α2,3-唾液酸酶和非特异性唾液酸酶)的铜绿假单胞菌混合液，在30min及48h后处死，取完整气管。其中8只称重、匀浆后做细菌定量培养；另外2只HE染色观察病理学改变。 结果： 1、成功分离了粘蛋白大分子，其总唾液酸含量大约8％，COPD组和肺炎组在总唾液酸含量、唾液酸α2,3-和α2,6-结构相对含量上均没有统计学差异(p＞0.05)； 2、针对唾液酸α2,3-结构的双糖NeuAcα2-3Gal、植物凝集素MAA和唾液酸酶对铜绿假单胞菌粘附粘蛋白有不同程度的抑制作用(与PBS组比较，NeuAcα2-3Gal组和两个唾液酸酶组均p＜0.01；MAA组p＜0.05)，而只有唾液酸酶可以减少生物被膜中的活菌数(p＜0.05)，两种唾液酸酶的作用强度均无明显差别(p＞0.05)；针对唾液酸α2,6-结构的双糖NeuAcα2-6Gal、植物凝集素SNA则没有类似的作用；COPD组和肺炎组的趋势相同(p＞0.05)； 3、COPD和肺功能正常的非感染患者支气管粘膜唾液酸转移酶ST3GalⅠ、Ⅲ、Ⅳ和ST6GalⅠ的mRNA表达水平均无明显差异(p＞0.05)，其积分光密度比分别为0.808±0.069vs0.773±0.102，0.681±0.117vs0.672±0.091，0.655±0.074vs0.692±0.094，0.768±0.093vs0.709±0.110； 4、细菌接种30min后，大鼠气管上皮部分脱落，纤毛缺失或倒伏，炎细胞浸润较轻，杯状细胞增生相对明显；48h后气管壁增厚，腺体细胞增生肥大，炎细胞浸润显著，达到了细菌感染的标准，但各组间无明显差异。针对唾液酸α2,3-结构的双糖、凝集素及唾液酸酶都能明显减少接种30min后气管粘附的菌落数(PBS组34.29±4.60×102cfu/g气管组织，NeuAcα2-3Gal组12.30±1.18，p＜0.01；MAA组27.32±3.95，p＜0.01；α2,3-唾液酸酶组28.43±5.42，p＜0.05；非特异性唾液酸酶组25.61±3.88，p＜0.01)，只有双糖和唾液酸酶能减少接种48h后气管的菌落数(PBS组1939.95±266.34×102cfu/g气管组织，NeuAcα2-3Gal组1635.93±162.63，α2,3-唾液酸酶组1679.83±205.09，非特异性唾液酸酶组1686.40±159.02，均为p＜0.05)，两种唾液酸酶在各时相点的作用强度均无明显差异；唾液酸α2,6-结构的相关物质则没有类似的作用。 结论： 1、COPD和肺炎患者气道吸引物粘蛋白大分子的唾液酸总量及具体构成无明显差异； 2、COPD和肺炎患者在气道粘蛋白-铜绿假单胞菌相互作用上存在相同的趋势，具体表现在唾液酸α2,3-结构相关物质对细菌粘附粘蛋白大分子均有不同程度的抑制作用；唾液酸酶可以减少生物被膜中的活菌数； 3、尚未发现COPD患者气道粘膜有特异性的唾液酸转移酶mRNA表达水平增高，其急性加重期气道粘蛋白末端唾液酸结构的增多可能更主要是与感染直接相关； 4、唾液酸α2,3-结构相关物质能干预铜绿假单胞菌在盐酸致伤大鼠气管的粘附/繁殖，其中双糖和唾液酸酶的作用更明显； 综上，气道粘蛋白大分子末端唾液酸化水平在急性和慢性炎症中大致相当，其增高可能更主要是与感染直接相关；唾液酸α2,3-结构是铜绿假单胞菌一种主要的粘蛋白糖受体，有效地干预该结构可以影响粘蛋白-细菌相互作用，即使在体内也会有明显的抑制效果。相比较而言，双糖或寡糖是更有前途的抗粘附剂，将成为抗细菌感染新策略的重要组成部分。

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摘要

前言

第一部分气道粘蛋白大分子的分离纯化与末端唾液酸分析

第二部分气道粘蛋白大分子末端唾液酸化对粘蛋白-铜绿假单胞菌相互作用的影响

第三部分支气管粘膜唾液酸转移酶mRNA表达水平的差异性

第四部分唾液酸相关物质对盐酸致伤大鼠气管铜绿假单胞菌感染的影响

全文结论

致谢

参考文献

照片

文献综述一气道粘蛋白糖基化的研究进展

文献综述二气道粘蛋白与铜绿假单胞菌的相互作用

博士在读期间发表的论文