遗传性非息肉病性结直肠癌中错配修复基因甲基化的研究

摘要

背景遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer，HNPCC)是一种常染色体显性遗传性疾病，由错配修复(mismatchrepair,MMR)基因种系突变引起，占所有结直肠癌的5％-10％。HNPCC最有效的治疗手段是内镜下或外科手术切除肿瘤，如果能早期发现原发和复发肿瘤，并及时治疗，可以明显改善预后。MMR基因种系突变的检测已经成为HNPCC确诊的金标准，但是较多的研究提示部分家系(包括一些高度微卫星不稳定肿瘤家系)始终找不到已知MMR基因种系突变。有研究表明错配修复基因启动子区CpG岛的过度甲基化也是导致基因失活、肿瘤发生的一种机制。迄今，有关HNPCC患者基因组DNA中MLH1、MSH2过甲基化检测报道较少，检测MMR基因的甲基化可能为HNPCC的筛选和监测提供一种手段，并为HNPCC的诊断、治疗提供一个新的思路。 目的：了解国人遗传性非息肉病性结直肠癌中错配修复基因MLH1、MSH2启动子区CpG岛的过甲基化状态，探讨MLH1、MSH2基因DNA甲基化与遗传性非息肉病性结直肠癌发生的关系，从而为HNPCC的筛选和监测提供一种手段，并为HNPCC的诊断、治疗提供一个新的思路。 材料与方法： 研究对象：本科收集的106个HNPPC家系中先证者，经微小突变检测和大片断缺失检测后，以未发现种系突变的47个HNPCC患者标本为研究对象。后期，又增加符合阿姆斯特丹标准II(AC-II)的同一家系标本4个，这些患者先期已证实有MSH2基因突变。 方法： 1)基因组DNA提取：按试剂盒提供的步骤进行操作，所提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，使用紫外分光光度计进行定量后于-20℃保存。 2)基因组DNA的硫化处理：按试剂盒提供的步骤进行操作，对至少1μg的基因组DNA进行转化，处理后的DNA于-20℃保存。 3)用MSP法检测MLH1、MSH2基因启动子区的甲基化状态：同一标本以甲基化引物和非甲基化引物分别进行PCR扩增。PCR产物在2％的琼脂糖凝胶上电泳。紫外灯下观察目的条带。判定标准：若扩增出M(methylation)的特异性条带，则说明有甲基化：仅有M条带为完全甲基化，同时有M条带和U(unmethylation)条带为部分甲基化；若仅扩增出U的特异性条带，则说明无甲基化。 结果：(1)在47个标本中，发现6个存在MLH1基因启动子区过甲基化，发生率为12.8％。分析MSP电泳图可见，存在MLH1基因启动子区甲基化的6个标本包括：4个完全甲基化，2个部分甲基化；(2)在36个标本中，发现27个存在MSH2基因启动子甲基化，发生率75.0％，其余9个(25.0％)为非甲基化。由电泳图可见，存在MSH2基因启动子甲基化的27个标本只扩增出特异性条带M，表现为完全甲基化，其余标本仅扩增出特异性条带U，表示这9个标本除未检出微小突变和大片段缺失外，也未发现有甲基化现象；(3)后加入4个标本(同属一家系，且已证实有MSH2基因突变)，由电泳图可见，存在MSH2基因启动子完全甲基化。 结论：(1)在遗传性非息肉病性结直肠癌中，MSH2基因启动子区的CpG岛有高频率的甲基化，是肿瘤发生过程中的一个重要因素；而MLH1基因启动子区甲基化在遗传性非息肉病性结直肠癌中相对少见；(2)在实验中发现，DNA甲基化主要发生在AC-II家系中，提示基因过甲基化可能有遗传的特性，即表遗传学机制可能具备遗传性；(3)在其中一个家系中，MSH2种系突变合并MSH2基因启动子CpG岛过度甲基化现象，除证实基因甲基化状态和种系突变一样具备遗传特性外，也提示二者对肿瘤的发生可能有协同作用。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前言

第一部分遗传性非息肉病性结直肠癌MLH1基因甲基化的研究

材料与方法

实验结果

第二部分遗传性非息肉病性结直肠癌MSH2基因甲基化的研究

材料与方法

实验结果

讨论

全文结论

展 望

致 谢

参考文献

文献综述遗传性非息肉病性大肠癌DNA甲基化研究进展

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