追踪性眨眼条件反射建立过程中豚鼠小脑D-I核的作用研究

摘要

背景与目的： 学习和记忆是脑的高级功能，学习是中枢神经系统适应环境变化并获得新行为和习惯的过程，记忆是学习后经验的储存和保持。小脑(Cerebellum，CE)是大脑皮层下的一个重要运动调节中枢，它有控制和调节运动，特别是随意性技巧运动的功能，也参与调节姿势及肌紧张和维持身体平衡，其最主要的作用是协调随意运动的执行。然而，近年越来越多的研究表明，小脑除参与精细动作调控以外，还参与其他重要功能，例如感觉运动学习和记忆。国内外近年来研究表明，经典瞬膜/眨眼条件反射(nictitating membrane/Eyeblink Classical ConditioIung，NM/EBCC)是运动学习研究的理想模型，在该模型上一系列研究提示，小脑在EBCC建立过程中具有不可或缺的作用。 EBCC基本训练过程是：条件刺激(CS)，如声音或光信号，与非条件刺激(US)，如向角膜吹气或电刺激眶周反复配对呈现，可以训练动物学会对条件刺激产生行为性条件反应(conditioned reflex，CR)。根据CS、US出现的时间是否重叠.又可分为追踪性眨眼条件反射(trace eyeblink conditioning，TEBC)和延迟性眨眼条件反射(delay eyeblinkconditioning，DEBC)。在EBCC训练成功的动物，CR先于UR出现，从而使动物可以回避伤害性刺激，起到自身保护的作用。眨眼条件反射涉及到大量运动核团和肌肉的高度协调性活动，整个行为训练过程是动物建立对中性刺激的防御反应的过程，已有研究提示，小脑、海马分别参与DEBC、TEBC的建立过程。 小脑在解剖学上可分为小脑皮层和小脑深部核团两个不同部分，小脑深部核团包括齿状核(dentate nucleus)、中位核(interpositus nucleus)和项核(fastigial nucleus，FN)，其中齿状-中位核(D-I核)作为小脑重要的输出核团，与大脑边缘系统海马之间存在特殊纤维联系，而大脑边缘系统的海马是公认的记忆相关结构，因此这种联系很可能是小脑参与运动及认知学习的结构基础。 早期研究发现，眨眼条件反射的建立主要与海马有关，而后期的大量研究表明，海马CA3区在追踪性眨眼条件反射的建立过程中是不可或缺的，而延迟性眨眼条件反射则主要依赖于小脑。但近年来采用切除、毁损、蝇蕈醇(muscimol)注射选择性失活技术等研究发现，在去除大脑皮层、海马甚至丘脑等组织后，动物仍能部分学会TEBC，这提示TEBC的建立涉及远较DEBC更为复杂的神经机制。Krupa等采用3H_ muscimol注射失活技术，证实TEBC记忆痕迹可能形成并储存在小脑深核区域。Linden DJ在眨眼条件反射模型上采用了在体细胞水平的电活动观测技术，在记录动物的整体行为反应的同时，同步记录神经元水平的单细胞电活动，将整体行为和细胞水平的研究结合起来进行分析，结果也有类似发现。但小脑及其核团究竟是否参与TEBC的建立？其突触机制是什么？迄今尚无定论。 突触可塑性在改变中枢神经元活动尤其是学习记忆等高级认知功能方面具有重要意义。突触素(Synaptophysin，Syn)是突触囊泡膜上的特异性蛋白质，与突触结构和功能密切相关。在神经组织中，它特异地定位于所有轴突终末的突触小泡膜上，因此Syn可作为突触的特异性标记物之一，反映轴突的终末结构分布。近年来，很多研究观察了突触素在学习记忆中的作用尤其是在空间学习中的表达变化，研究工作证实，作为与联合学习有关的突触功能可塑性的重要形式长时程增强(Long-term potentiation.LTP)和长时程抑制(Long-term depression，LTD)现象，存在于EBCC的建立过程中。在TEBC的建立过程中海马LTP的重要作用已得到认可；另一方面，也有研究认为小脑LTD可能主要参与小脑的运动学习过程，小脑皮层与小脑深核LTD在DEBC建立过程中是不可或缺的。但小脑在TEBC建立与保持过程的作用，尤其是小脑深核在其中的作用，目前争论较大。研究发现在小脑环路中，D-I核与小脑皮层同时接收条件刺激和非条件刺激的信息，二者在结构上都有可能参与条件刺激和非条件刺激之间的整合过程。因此，D-I核在TEBC中突触可塑性变化值得我们关注。 研究D-I核在TEBC建立过程中的作用既能为明确小脑的运动学习功能及机制提供支持，也能为更加全面地理解学习记忆神经机制提供有益的帮助，具有非常重要的理论意义。 方法: 本研究主要是：①通过眼肌电记录及“随动”气流给气刺激装置，实现眨眼信号记录和惩罚刺激装置均完全“随动”的实验要求，从而在清醒无制动的豚鼠上建立经典追踪性眨眼条件反射，为小脑运动学习及机制的进一步研究提供技术支持。②采用在体细胞外记录技术记录并观察豚鼠小脑D-I核神经元放电活动的变化，通过刺激前后放电活动直方图(Peri-stimulus time histogramme，PSTH)反映神经元活动情况，研究小脑D-I核神经元在TEBC建立过程中的活动特征。③采用免疫组织化学的方法，研究TEBC建立后小脑D-I核内突触素的表达变化，探讨小脑参与TEBC建立的形态学机制。 结果: 1.本实验采用金属电极埋植技术，运用眼肌电活动记录及简易“随动”气流给气刺激装置，以声音作为CS，以气流作为US，以眼肌电判断其眨眼行为。实验发现随着训练时间的增加，CR习得率逐渐升高，于训练的第10天，CR习得率达到一个相对稳定的状态，其在第15天和第20天的CR仍有较高的保持率，即CR习得率随时间的延长而升高且可保持较长时间，表明在清醒无制动的豚鼠上可以成功建立TEBC模型。 2.采用在体细胞外记录技术，在成功建立TEBC模型的基础上，记录观察TEBC建立过程中豚鼠小脑D-I核神经元放电变化。发现小脑D-I核神经元主要存在刺激相关神经元、CR习得相关神经元及放电不相关神经元，其中：1)刺激相关神经元又分为CS兴奋相关神经元、US兴奋相关神经元，该类神经元的放电活动仅与CS或US相关，与行为训练及CS、US是否存在配对无明显相关性。2)CR习得相关神经元即trace相关神经元，该类神经元的放电活动与CR反应密切关系，仅在CS、US配对组中记录到，其可能参与TEBC的建立过程。3)放电不相关神经元的放电活动与CS、US及条件反射的建立均无相关性。 3.采用免疫组织化学研究了TEBC的建立前后小脑D-I核内突触素的表达变化，实验发现随着训练时间的增加，配对组的Syn阳性颗粒数量明显增多，颜色加深，第6天可见明显Syn阳性纤维束形成，第10天与第15天的Syn阳性纤维增多，排列整齐，结合同步行为训练提示Syn的表达与训练成绩之间存在一定的相关性。 结论: 综上所述，小脑齿状-中位核是TEBC建立和表达所需神经环路的重要组成部分，是TEBC模型获得和记忆存储的重要脑区，D-I核通过神经元活动模式的变化主动参与TEBC的建立过程，而D-I核突触数量与分布的改变可能是其形态学基础，这为探讨小脑在运动学习记忆中的可能机制提供了形态学依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

第一部分清醒无制动豚鼠追踪性眨眼条件反射模型的建立

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第二部分追踪性眨眼条件反射建立过程中豚鼠小脑D-I核神经元活动变化

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第三部分追踪性眨眼条件反射建立后豚鼠小脑D-I核突触素表达变化

材料和方法

结 果

小 结

参考文献

全文总结

致 谢

照 片

文献综述 突触素在学习记忆中的相关作用研究

攻读硕士期间发表及待发表的文章