以PLGA纳米粒为载体的内耳局部给药系统的构建及递药机制研究

摘要

内耳疾病和脑部疾病一直是困扰人类的两大疾病,目前主要的治疗方式是全身给药。但由于血-内耳屏障(BIB)和血-脑屏障(BBB)的存在,限制了绝大多数药物经血入耳和脑,全身应用的效果并不理想且毒副作用较大。研究发现,采用临床常用的内耳局部给药方法——鼓室给药(IT),药物可经圆窗膜(RWM)进入内耳外淋巴(PL),并可通过耳蜗小管转运至脑脊液(CSF)及脑,提示经内耳局部给药可用于内耳疾病或脑部疾病的治疗。新型可生物降解和生物相容性的聚乳酸羟基乙酸(PLGA)纳米传递系统,因其自身优点,如能够有效减少药物的降解,控制药物释放,改善药物体内分布,受到学术界的广泛关注。本课题选择理化性质差异较大、各具特色的三种模型药物,一种是脂溶性小分子荧光探针——香豆素-6,一种是水溶性大分子蛋白药物——重组人干扰素(IFN)α-2b,另一种是中药复方多组分——丹参-三七的有效组分(丹酚酸B、丹参酮IIA、三七皂苷R1(R1)、人参皂苷Rg1(Rg1)、人参皂苷Rb1(Rb1)),较全面深入地研究PLGA纳米粒经鼓室给药携载各类药物穿过RWM,输送至内耳和脑部的可行性及其递药机制。
　　采用乳化溶剂挥发法制备得到载香豆素-6 PLGA纳米粒。透射电镜观察发现纳米粒形态较圆整,激光粒度仪测得平均粒径为135nm,多分散指数(PDI)为0.17,葡聚糖凝胶过柱法测得包封率为49.6％。纳米粒体外泄漏百分率低于2%,表明香豆素可作为PLGA纳米粒荧光标记物,较准确地示踪纳米粒的体内转运行为。采用单侧IT将香豆素-6导入豚鼠耳蜗,于不同时间点采集体内组织(给药侧PL、对侧PL、CSF、血浆),结果显示荧光探针纳米粒体内转运通路为:给药侧PL→CSF→对侧PL。纳米粒制剂与溶液剂相比,前者在给药侧PL和CSF中香豆素-6的Cmax分别是后者的10.91、10.01倍,相对生物利用度分别是后者的467%、850%。表明,PLGA纳米载体能有效促进小分子药物穿过RWM,明显增加内耳和脑部(CSF)的药量,提高局部生物利用度。
　　采用复乳溶剂挥发法制备得到载IFNα-2b PLGA纳米粒,得到的纳米粒表面光滑圆整,平均粒径249nm,PDI为0.13。葡聚糖凝胶过柱法测得包封率为21.8%。IFNα-2b纳米粒分别采用IT和静脉给药(IV),结果显示IFNα-2b经IT分别在PL、CSF和脑组织的AUC和Cmax比IV高70.98、209.89,0.73、0.46和2.34、0.21倍;而且与IT IFNα-2b溶液剂比较,前者在PL、CSF及脑组织中的相对生物利用度分别是后者的7121%、2193%、1863%。表明,PLGA纳米载体能有效促进大分子药物穿过RWM,提高药物在内耳及脑部的局部生物利用度。
　　采用复乳溶剂挥发法制备载丹参-三七复方组分PLGA纳米粒,单因素实验优化得到最佳处方为:内水相为蒸馏水,油相与外水相体积比1:3,PLGA规格为LA/GA=50:50,乳化剂为LABRAFILM1994 CS和司盘-80(1:1)的混合乳化剂。得到的纳米粒呈类圆形,平均粒径154nm,PDI为0.007。反透析法测得R1、Rb1、Rg1、丹酚酸B、丹参酮IIA的包封率分别为37.87%、44.98%、93.56%、92.88%、91.81%。体外释放结果显示纳米粒具有良好的缓释特征。该复方组分纳米粒分别采用IT和IV,结果显示纳米粒经IT后药物在PL、CSF和脑中的浓度明显高于IV;而且与复方组分溶液剂相比,前者在PL中丹酚酸B、丹参酮IIA、R1、Rg1、Rb1的相对生物利用度分别是后者的509%、6091%、2375%、1288%、2350%,在CSF中分别是后者的524%、1165%、1422%、1185%、1232%,在脑组织中R1、Rg1、Rb1分别是后者的13599%、6063%、16690%。表明,PLGA纳米载体能有效促进复方多组分穿过RWM,提高药物在内耳及脑部的局部生物利用度。
　　采用双侧颈总动脉合并硝普钠降压法构建豚鼠脑缺血再灌注模型,评价载丹参-三七复方组分PLGA纳米粒经内耳局部给药对脑缺血的治疗效果。将豚鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药物组、IT组和IV组,检测血清及脑组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮合酶(NOS)活力。IT组和IV组血清和脑组织中MDA含量和NOS活力均显著降低,SOD活力显著升高,与模型组和假手术组比较,差异具有统计学意义(P<0.01),且IT组对脑缺血的改善作用优于IV(P<0.01)。此外,初步考察载丹参-三七复方组分PLGA纳米粒经内耳局部给药对耳蜗的毒性。将豚鼠随机分为正常组、生理盐水组和纳米粒组,分别测定耳蜗组织中SOD、NOS活力以及MDA含量。生理盐水组和纳米粒组耳蜗中MDA、SOD和NOS水平与正常组比较均无显著变化(P>0.05),初步说明IT纳米粒未引起内耳功能损伤。
　　综上所述,本文研究结果表明,以PLGA纳米粒为载体的内耳局部给药系统,能够有效携带小分子药物、大分子药物和中药复方多组分通过RWM,显著提高内耳和脑部的局部生物利用度,是输送药物进入内耳及脑部的有益尝试和新的突破。

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第一章 前言

1 BIB和BBB严重限制内耳疾病与脑部疾病的治疗效果

2 内耳局部给药可绕开BIB和BBB将药物递送至内耳及脑

3 纳米传递系统在内耳局部给药的应用进展

4 PLGA纳米粒作为内耳局部给药载体的研究现状

5 本课题的研究内容及意义

第二章 载香豆素-6 PLGA纳米粒的制备及经内耳局部给药的递药机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 载IFNα-2b PLGA纳米粒的制备及经内耳局部给药的递药机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 载丹参-三七复方组分PLGA纳米粒的制备及经内耳局部给药的递药机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第五章 载丹参-三七复方组分PLGA纳米粒经内耳局部给药的药效学及初步毒性研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第六章 结论与展望

参考文献

英文缩写注释

攻读硕士期间发表的论文

致谢