利用毛细管电泳-单链构象多态性技术鉴定常见血液感染病原菌的研究

摘要

背景随着社会老龄化进程的加快及HIV感染人群的增多,免疫力低下群体的范围也在不断扩大。每年有大量的患者死于血液感染[1,2],尤其是因败血症导致的新生儿死亡[3]。据全国医院感染监控网的报告显示,菌血症的发病率在医院内感染中的构成比为1.3％,发病率为48.56/10万[4]。在美国因血液感染所致的败血症是导致病人死亡的十大原因之一[5]。因此,及时诊断感染病原菌并给予抗菌治疗,是降低死亡率的重要一步。培养法作为细菌诊断的金标准,耗时长,操作繁琐,对营养要求高的细菌难以检出(如肺炎链球菌等),而且易受抗生素的影响,常导致某些细菌无法生长。因此探索建立一种快速检测血液中的微量病原菌的方法成为亟待解决的问题。细菌的核糖体小亚基rRNA是近年来进行细菌分类和鉴定研究的热点,为病原菌的分子生物学快速检测提供了理想靶点[6-9]。
　　 20世纪80年代,在传统平板凝胶电泳(slab gel electrophoresis,SGE)的基础上发展了毛细管电泳技术(ca-pillary electrophoresis,CE),用于快速分离生物大分子。Orita等[10]在同期发展了用于基因分型的单链构象多态性分析技术(single strand conformationpolymorphism,SSCP)。后来,Kuypers等[11]将两项技术相结合形成了CE-SSCP来进行基因的突变分析。由于该技术具有样品用量少、灵敏度高、分析能力强、定量性能好等诸多优点,在生命科学中已被广泛应用于基因突变检测、PCR产物分析、SNP的快速分型以及mRNA定量[12]、抗菌活性分析[13]等。本研究利用通用引物PCR,结合毛细管电泳-单链构象多态性分析技术(CE-SSCP)对常见的血液感染病原菌:金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、肺炎链球菌进行了检测,进而建立了一种快速检测常见血液感染病原菌的方法。
　　 方法1.经查阅文献,选取常见血液感染病原菌:金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、肺炎链球菌为研究对象,通过NCBI查询其全基因组序列,利用ClustalX1.81软件进行多重序列比对,查找16SrDNA、23S rDNA基因序列的保守区域,在此保守区设计通用引物。2.提取上述病原菌标准菌株的基因组DNA后,分别对16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区进行PCR扩增,然后进行CE-SSCP分析,建立标准菌株的CE-SSCP图谱并进行机器码识别。同时对该方法的敏感度进行研究。3.收集临床菌株进行CE-SSCP分析,所获得的图谱与所建立的标准菌株图谱进行比较验证。同时将CE-SSCP法与传统培养法进行比较。
　　 结果1.在16S rDNA和23S rDNA的保守区域设计的通用引物,能够一次对所研究的七种病原菌进行扩增,且片段长度与实际相符合,条带结果清晰,未见明显的非特异性扩增条带和引物二聚体。2.16S rRNA基因的PCR产物经CE-SSCP分析,七种病原菌具有不同的等位片段长度(Cv≤0.046％)和出峰时间点(Cv≥1.33％):前者重复性由于后者。经多次测量计算出其等位片段长度范围为:金黄色葡萄球菌(317.40-317.61),大肠杆菌(309.83-309.99),铜绿假单胞菌(305.30-305.59),表皮葡萄球菌(316.34-316.63),肺炎克雷伯菌(307.76-307.96),粪肠球菌(327.28-327.57),肺炎链球菌(315.86-315.62)。16S-23S rDNA间区经分析后,也呈现不同的CE-SSCP图谱,其图谱经机器码识别,可使细菌的差异鉴别更加快捷。3.对七种血液感染病原菌临床菌株进行检测,所有细菌都在所建立的等位片段长度范围之内。该法与培养法的符合率为94.8％,敏感度达18 CFU/ml。
　　 结论1.所设计的通用引物能够一次对所研究的七种病原菌进行扩增,且条带结果清晰,未见明显的非特异性条带和引物二聚体。2.16S rRNA基因的PCR产物经CE-SSCP分析,可同时对七种病原菌进行鉴定,这对混合感染的检测具有重要意义。通过对CE-SSCP两个判定指标的研究,认为利用等位片段长度进行细菌鉴定要优于出峰时间点,从而提高了细菌检测的准确性。对16S-23S rRNA间区的CE-SSCP图谱识别引入机器码技术,使细菌的差异鉴别更加快捷,为开发自动化分析软件提供了思路。3.利用该方法在4～6小时内可对常见的七种血液感染病原菌进行检测,且快速、敏感,操作简便,为其临床应用奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写一览表

前言

第一部分 16S rRNA和16S～23S rRNA检测靶基因的研究

材料与方法

结果

讨论

第二部分 常见血液感染病原菌标准菌株CE-SSCP图谱的建立

材料与方法

结果

讨论

第三部分 常见血液感染病原菌临床菌株CE-SSCP分析研究

材料与方法

结果

讨论

全文总结

致谢

参考文献

文献综述一 毛细管电泳-单链构象多态性分析技术

文献综述二 16S-23S rRNA基因间区在快速鉴定病原菌中的应用进展

攻读学位期间申请的专利和发表的文章