PTEN调控增生性瘢痕成纤维细胞凋亡及相关功能的机制研究

摘要

有关增生性瘢痕(hypertropic scar，HS)发病机制的研究，是创伤修复领域的难点和热点，现认为，增生性瘢痕是皮肤深度烧伤、严重创伤或者感染后异常修复的结果，病理特点为真皮层中成纤维细胞的异常增殖和细胞外基质的过度沉积。由于增生性瘢痕的过度增殖与挛缩会造成局部外观的改变以及周围器官、关节的功能障碍，给患者的身心带来巨大的痛苦。目前治疗瘢痕的方法很多，但均存在各自的局限性及副作用，采用单一的治疗方法很难获得理想的效果。因此，深刻揭示增生性瘢痕的病理机制，可为寻求一种有效的治疗方法提供理论依据。
　　 皮肤受到创伤后，愈合时的主要效应细胞是真皮层中的成纤维细胞；现有的研究表明，在增生性瘢痕中，成纤维细胞常常表现为过度增殖、凋亡受抑制并分泌大量的细胞外基质(ECM)，上述异常的细胞生物学行为是增生性瘢痕形成的主要原因。增生性瘢痕成纤维细胞的增殖、凋亡及分化等行为受到体内多种因素的影响，近些年研究发现，某些凋亡相关基因，如：fas，p53，bcl-2等，参与了皮肤成纤维细胞的增殖与凋亡的调控，但其确切的调控机制有待于进一步阐明。
　　 第10号染色体丢失的张力蛋白同源的磷酸酶基因(phosphates and tensing homologue deleted on chromosome 10，PTEN)是近年来发现的定位于10q23.3的一个肿瘤抑制基因，其编码的蛋白具有双重特异性磷酸酶活性，是目前发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，其作用机制主要是通过负性调控磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT、MAPK细胞外信号调节激酶(ERK)以及黏着斑激酶(FAK)等信号通路，从而达到抑制肿瘤细胞周期的目的，并且能够诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞黏附、迁移和转分化。在对肺间质纤维化、风湿性关节炎、肝硬化等纤维化疾病的研究中发现，PTEN在上述纤维化疾病组织中成纤维细胞中表达水平受抑制，通过腺病毒转染野生型PTEN到成纤维细胞中，使细胞过表达PTEN，可以抑制纤维化肺组织及风湿性关节炎滑膜组织中成纤维细胞的增殖。因此，PTEN作为一个潜在的抗纤维化靶点，被越来越多的学者所重视。
　　 我们在前期的实验中观察到，HS组织内的PTEN蛋白的表达水平，与正常皮肤组织相比明显降低，而p-AKT表达增高，二者呈负相关。联系文献，我们可以推测：在组织创伤的异常修复中，组织中由于PTEN蛋白表达减少，丧失对下游信号转导途径PI3K/AKT等的负调控，抑制细胞增殖的作用减弱，从而导致了组织创伤修复时，成纤维细胞异常增生，胶原分泌增加，细胞外基质增多，最终导致了增生性瘢痕的形成。
　　 目的：观察增生性瘢痕中PTEN、p-AKT蛋白质和mRNA的表达特征，并探讨PTEN对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖、凋亡及转分化的调控作用及机制，为深入研究PTEN在HS发病机制中的作用途径以及治疗学中提供理论依据，也将为进一步完善PTEN在增生性瘢痕中的信号转导分子机制提供帮助。
　　 方法：收集人体的正常皮肤(normal skin，NS)以及增生性瘢痕组织，应用组织块法分离培养增生性瘢痕成纤维细胞(HSFB)及正常皮肤成纤维细胞(NSFB)，分别进行实验。应用免疫组化、激光共聚焦以及蛋白电泳等方法观察PTEN及p-AKT在HS和HSFB中的表达，并采用腺病毒转染的方法，分别在两种成纤维细胞中过表达PTEN蛋白，并利用PTEN特异性抑制剂bpv(pic)来抑制PTEN功能，分别观察PTEN对两种成纤维细胞增殖、凋亡及分化等各项功能的影响，最后探讨PTEN调控成纤维细胞可能的信号途径。
　　 结果：
　　 1.采用RT-PCR、免疫组化及Western Blot技术检测发现，增生性瘢痕组织中PTEN蛋白水平低于正常皮肤组织，而p-AKT蛋白的表达则相反。
　　 2.激光共聚焦下观察，在正常皮肤成纤维细胞中，PTEN主要定位于胞浆以及胞核中，呈强阳性，而p-AKT表达很弱；而在增生性瘢痕成纤维细胞中，PTEN几乎无表达，p-AKT呈阳性，定位于成纤维细胞的胞浆以及胞核中。
　　 3.PCR和测序证实获赠的Ad-PTEN及含GFP示踪蛋白的Ad-luc病毒液序列正常，Ad-PTEN病毒液可表达目的蛋白PTEN；通过反复感染AD293细胞，获得了较高滴度的病毒液，可有效感染皮肤成纤维细胞。
　　 4.MTT结果显示，上调PTEN后，增生性瘢痕成纤维细胞增殖受到明显抑制，而正常皮肤成纤维细胞的增殖变化不显著；bpv(pic)则可明显促进正常皮肤成纤维细胞的增殖，对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖影响不明显。生长曲线结果与MTT结果符合。
　　 5.流式细胞术行细胞周期检测，结果显示，上调PTEN可使增生性瘢痕成纤维细胞阻滞于G0/G1期，正常皮肤成纤维细胞无明显变化；抑制PTEN功能，可使正常皮肤成纤维细胞进入活跃增殖的S期。进一步进行PCNA的免疫细胞化学染色，也印证了上述结果。
　　 6.TUNEL法检测细胞凋亡显示，上调PTEN后，增生性瘢痕成纤维中，凋亡细胞明显增多，而正常皮肤成纤维细胞无明显变化。
　　 7.上调PTEN可显著提高增生性瘢痕成纤维细胞中caspase-3的活性。而抑制增生性瘢痕成纤维细胞中PTEN的功能后，与未作干预的增生性瘢痕成纤维细胞对比，caspase-3的活性差异不显著。进一步利用PI染色及流式细胞术分析成纤维细胞的早期凋亡水平，结果也相同。
　　 8.3H-脯氨酸掺入法实验中，上调PTEN可特异性的抑制增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成，而抑制PTEN的功能，可提高正常皮肤成纤维细胞胶原的合成。进一步利用RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白也得到了相同的结果。
　　 9.上调PTEN可抑制增生性瘢痕成纤维细胞中TGF-β1蛋白的表达。
　　 10.上调PTEN可降低增生性瘢痕成纤维细胞中α-SMA蛋白的表达，从而抑制成纤维细胞的转分化。
　　 11.Western Blot结果显示，上调PTEN后，增生性瘢痕成纤维细胞中胞内AKT、ERK1/2、MEK1/2、c-Raf、p38蛋白的磷酸化水平均呈不同程度的降低，其中AKT、ERK1/2的活化水平尤为明显。
　　 结论：
　　 1.PTEN在增生性瘢痕组织中的表达低于正常皮肤组织，而p-AKT的表达则相反。
　　 2.成功获得了稳定过表达PTEN的HS成纤维细胞和NS成纤维细胞。
　　 3.过表达PTEN能有效的诱导细胞凋亡，抑制HS成纤维细胞的增殖，其抑制增殖和诱导凋亡的作用，与影响细胞周期和凋亡相关蛋白的表达有关。
　　 4.PTEN能影响HS成纤维细胞的生物学功能，包括抑制细胞胶原的合成、减少TGF-β1及α-SMA蛋白的表达，抑制其转分化。
　　 5.PTEN调控HS成纤维细胞的增殖与活化的机制可能为Ras→Raf→MEK→ERK/p38途径以及PI3K→AKT途径。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写一览表

前 言

第一部分 PTEN在增生性瘢痕组织及成纤维细胞中的表达

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 重组腺病毒Ad-PTEN的鉴定及增生性瘢痕成纤维细胞的稳定转染

第一节 重组腺病毒Ad-PTEN的鉴定与扩增

实验材料

试验方法

结 果

讨 论

第二节 重组腺病毒Ad-PTEN稳定转染增生性瘢痕成纤维细胞

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分 PTEN对HSFB凋亡、增殖及功能的影响

第一节 PTEN对增生性瘢痕成纤维细胞凋亡及增殖的影响

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

小 结

第二节 PTEN对增生性瘢痕成纤维细胞生物学功能的影响

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

小 结

第四部分 PTEN对增生性瘢痕成纤维细胞相关信号通路作用的初步研究

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

小 结

结 语

全文结论

参考文献

致谢

文献综述 抑癌基因PTEN的研究进展

参考文献

研究生期间撰写和发表文章