缺氧诱导因子1在间歇性缺氧预处理心脏保护中的作用研究

摘要

研究背景：
　　随着社会发展,冠状动脉粥样硬化性心脏病对人类健康的危害日益突出,虽然近年来,大量新的治疗手段、新的药物应用于临床,冠心病防治水平有所提高,但缺血性心脏病及其所导致的心力衰竭、心律失常、心肌梗死仍然具有非常高的患病率、致死率。寻找经济有效的治疗方法一直是临床医学领域的热点之一。自Murry发现缺血预适应对心肌具有保护作用以来,人们一直在探索更加简便易行、效果确切的预处理保护手段,缺氧预适应、缺血后处理等方式都是在此领域的延伸,间歇性缺氧预处理作为一种新的预处理模式,在多数研究中也被证实其具有缺血预适应样心肌保护作用。间歇性缺氧不同于持续性缺氧,不仅能保持持续性缺氧适应对于心脏的保护作用,并且不易出现长期持续性缺氧对机体导致的缺氧性损伤,因此是一种很有应用前景的心肌保护方式。由于不同的学者针对不同的动物种属以及不同的研究目标有不一致的间歇性缺氧预处理方案,甚至在个别研究中由于间歇性缺氧严重程度以及持续时间的不一致,导致了截然相反的实验结果。因此建立简单、易操作的动物模型与统一、有效的缺氧预处理方案,将有助于我们进一步系统、深入研究间歇性缺氧预处理对于心肌缺血性损伤的保护机制,尤其是在临床医学中的应用前景,具有深远的意义。
　　缺氧诱导因子-1(HIF-1)是一种机体在缺氧适应性调节中具有重要作用的转录活化因子,通过调控其靶基因可参与血管新生、细胞分化/生存、红细胞合成、调节糖代谢、氧转运等机体对缺血缺氧的适应性反应。HIF-1的表达和激活主要受细胞内氧浓度的调节及其他信号转导通路的调节。通过运用HIF-1的干预性药物抑制或促进HIF-1的表达,有助于进一步了解间歇性缺氧预处理过程中,HIF-1的表达规律及其在抗缺血/再灌注损伤心肌保护中的作用机制,将可能为缺氧缺血性疾病的机制及治疗提供新的观点和方法。
　　第一部分，间歇性缺氧预处理的心脏保护作用
　　目的:
　　在已建立的间歇性缺氧预处理大鼠动物模型基础上,通过手术模拟心肌缺血/再灌注,评价不同间歇性缺氧预处理时相点对心肌缺血/再灌注损伤的保护效应。
　　方法:
　　Wistar大鼠(250±30g)35只,随机分为常氧对照组(Control)、间歇性缺氧预处理组(IH1d、7d、14d、28d),共5组,每组7只,分别于自制小动物间歇性缺氧实验舱进行预处理(30s,1min1circle,4h/d)。缺氧终点各组分别行心肌缺血/再灌注实验(缺血30min后再灌注4h)。实验终点各实验组分别检测心肌梗死范围(TTC染色法)、心肌细胞凋亡(TUNEL法),并同时测定心肌组织MDA与SOD水平。
　　结果:
　　间歇性缺氧预处理可缩小缺血/再灌注后实验大鼠心肌梗死范围、降低心肌细胞凋亡指数、增强心肌抗氧化损伤能力,间歇性缺氧预处理1天后即可呈现上述心肌保护效应,在缺氧预处理7~14天后效应达最大化,至预处理28天保护效应呈弱化趋势。
　　结论:
　　成功制作间歇性缺氧预处理大鼠模型并通过手术模拟心肌缺血/再灌注损伤,实验模型成熟可靠,实验结果体现出间歇性缺氧预处理在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用;本实验采用的间歇性缺氧预处理模型对于心肌抗缺血/再灌注损伤的保护效应最大化时间点为间歇性缺氧预处理7天。
　　第二部分，HIF-1α调节剂对间歇性缺氧预处理心脏保护作用的影响
　　目的:
　　研究HIF-1α抑制剂2ME2与增强剂DMOG对大鼠间歇性缺氧预处理心肌保护效应的影响及其对心肌HIF-1α基因表达的作用。
　　方法:
　　Wistar大鼠(250±30g)56只,随机分为常氧对照组(Control)、间歇性缺氧预处理组(IH)、间歇性缺氧预处理加HIF-1α抑制剂2ME2干预组(IH+2ME2)、间歇性缺氧预处理加HIF-1α增强剂DMOG干预组(IH+DMOG),共4组,每组14只,分别进行间歇性缺氧预处理。预处理终点各组又分为单纯预处理组与预处理+缺血/再灌注组(IR),单纯预处理各组分别检测VEGF与HIF-1αmRNA及其蛋白的表达,预处理+缺血/再灌注组分别检测心肌梗死范围、心肌细胞凋亡,检测心肌VEGF与HIF-1αmRNA及其蛋白的表达。
　　结果:
　　1.间歇性缺氧预处理可显著增强心肌VEGF与HIF-1αmRNA及其蛋白表达;DMOG干预可进一步提高其表达水平;2ME2干预后HIF-1αmRNA表达水平显著增加,但未检测到HIF-1α蛋白明显表达,VEGFmRNA及其蛋白表达均无显著变化。
　　2.缺血/再灌注实验后心肌VEGF与HIF-1αmRNA及其蛋白表达均明显增加,间歇性缺氧预处理组增加更为显著;间歇性缺氧预处理具有显著的心肌保护效应,DMOG干预可进一步增强抗缺血/再灌注损伤的心肌保护效应,并呈现出更高的VEGF与HIF-1αmRNA及其蛋白表达水平;2ME2干预组缺血/再灌注后心肌损伤较对照组加重,梗死范围扩大、细胞凋亡增加,HIF-1αmRNA表达水平显著增加,但HIF-1α蛋白与VEGFmRNA及其蛋白表达均无显著变化。
　　结论:
　　间歇性缺氧预处理可提高心肌对缺血/再灌注损伤的耐受,其机制和预处理后VEGF与HIF-1α蛋白表达上调有关,HIF-1α增强剂DMOG可通过进一步上调HIF-1α与VEGF表达水平增强心肌保护效应;HIF-1α抑制剂2ME2可抑制间歇性缺氧预处理及心肌缺血/再灌注后的HIF-1α转录活性,由此影响HIF-1α与VEGF蛋白的表达,导致心肌损伤加重。
　　第三部分，抗氧化剂对间歇性缺氧预处理心脏保护作用的影响
　　目的:
　　研究抗氧化剂NAC对大鼠间歇性缺氧预处理心肌保护效应的影响
　　方法:
　　Wistar大鼠(250±30g)56只,随机分为常氧对照组(Control)、间歇性缺氧预处理组(IH)、NAC干预组(NAC)、间歇性缺氧预处理加NAC干预组(IH+NAC),共4组,每组14只,分别进行间歇性缺氧预处理。预处理终点各组又分为单纯预处理组与预处理+缺血/再灌注组,单纯预处理各组分别检测心肌MDA与SOD,检测VEGF与HIF-1αmRNA及其蛋白的表达,预处理+缺血/再灌注组分别检测心肌梗死范围、心肌细胞凋亡、心肌MDA与SOD,VEGF与HIF-1αmRNA及其蛋白的表达。
　　结果:
　　1.间歇性缺氧预处理可降低缺血再灌注损伤后大鼠心肌MDA含量、增加心肌SOD活性,NAC干预亦可增强心肌抗氧化能力,缩小心肌梗死范围、减少心肌细胞凋亡,在本研究中其心脏保护效应低于单纯间歇性缺氧预处理。两者的心脏保护作用无显著叠加效应。
　　2.常氧下NAC干预不影响VEGF与HIF-1αmRNA及其蛋白表达;在缺氧或缺血/再灌注后可部分消除间歇性缺氧预处理诱导的HIF-1mRNA及蛋白表达增加。
　　结论:
　　间歇性缺氧预处理可通过抗氧化途径减轻心肌缺血/再灌注损伤,抗氧化剂与间歇性缺氧预处理在抗缺血/再灌注损伤机制方面可能具有共同作用通路,并可能前馈调节HIF-1α的表达。

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缩略语表

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摘要

第一章 前 言

第二章 间歇性缺氧预处理的心脏保护作用

2.1 材料和方法

2.2 实验结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 HIF-1α调节剂对间歇性缺氧预处理心脏保护作用的影响

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小 结

第四章 抗氧化剂对间歇性缺氧预处理心脏保护作用的影响

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

全文结论

参考文献

文献综述一HIF-1在间歇性缺氧预处理心脏保护中的作用

参考文献

文献综述二缺氧诱导因子-1结构、调控及其靶基因研究进展

参考文献

攻读博士期间发表的文章

致谢