氯喹在红内期灭活全虫疫苗抗红内期/红外期中的作用及机制

摘要

疟疾主要通过雌性按蚊叮咬传播，在热带地区及亚热带地区具有非常高的致病率和致死率，它仍然是全球危害最大的热带传染病之一。疫苗被认为是防治疟疾最经济、最有效的手段。在过去50年里，科学家们主要致力于疟疾亚单位疫苗的研制。然而，由于亚单位疫苗所针对的抗原决定簇相对较少，而且同一抗原在不同地理株之间存在明显的多态性，现有的亚单位疫苗并没有获得非常理想的防治疟疾效果。近年来，拥有丰富种类抗原的全虫灭活疫苗再次受到了疟疾专家的高度关注。研究已证实，遗传或物理减毒子孢子、物理灭活或遗传减毒全虫红内期疫苗均能有效地诱导小鼠和人类产生理想的免疫保护效果。
　　红内期灭活全虫疫苗(Whole-killed blood stage vaccine)是由感染疟原虫的红细胞经反复冻融制备的裂解产物(pRBC lysate)，在免疫佐剂氢氧化铝(alum)的辅助下，已证实能诱导小鼠产生较理想的免疫保护效果。然而，红内期灭活全虫疫苗需要108数量级才能诱导小鼠产生免疫保护作用，灭活的红内期疟原虫尚存在潜在的安全性问题，而且在实际推广应用中也受到明显的限制。因此，如何提高红内期灭活全虫疫苗的免疫原性，减少免疫剂量，是提高其在实际应用中可能性的重要方法。其中，选择合适的免疫佐剂是提高红内期灭活全虫疫苗的免疫原性的重要策略之一。
　　氯喹(Chloroquine，CQ)，作为抗疟药物，于1947年正式投入使用[3]，它能有效地杀灭红内期疟原虫，但对红外期子孢子则无明显杀伤作用[4]。有研究发现，CQ对机体的免疫系统具有一定的免疫调节作用，但是关于CQ是抑制还是促进机体的免疫应答尚存在很大的争论。鉴此，本研究首先观察了CQ能否增强红内期灭活全虫疫苗的免疫原性及抵御红内期疟原虫的攻击能力，并对其机制进行了初步的探讨;另外，鉴于红内期和红外期疫苗之间存在交叉保护作用，本研究还探讨了CQ能否同样增强红内期灭活全虫疫苗抗红外期子孢子的攻击能力。
　　1.CQ增强红内期P.y NSM灭活全虫疫苗的抗红内期效果:与对照组相比，灭活全虫疫苗能一定程度上诱导小鼠抗红内期的攻击，但其保护效果并不理想。在灭活全虫疫苗中添加CQ则能显著提高免疫小鼠抵御红内期疟原虫攻击的能力，在极短时间内完全清除攻击的红内期疟原虫，能100％的免疫保护机体，说明CQ能显著增强红内期P.yNSM灭活全虫疫苗的免疫效率。另外，间隔2W单独给予CQ并不影响小鼠的原虫血症，说明残留的CQ不是通过直接杀灭疟原虫而影响免疫效果的。
　　1) CQ增强红内期灭活全虫疫苗的免疫效果与剂量相关:不同剂量浓度的CQ(10mg/Kg，20mg/Kg，40mg/Kg)与P.y NSM红内期全虫灭活疫苗(pRBC lysate+Alum)混合后免疫小鼠，发现其免疫效果与CQ剂量具有一定的相关性，当CQ浓度为20mg/Kg时，灭活全虫疫苗免疫保护效果最佳。
　　2) CQ通过alum增强pRBC裂解产物的免疫原性:在用pRBCs lysate、CQ+pRBClysate、alum+ pRBC lysate、alum+CQ+pRBC lysate分别免疫小鼠后2W，用P.y NSMpRBC攻击，结果发现，CQ+pRBC lysate免疫也不能增强免疫小鼠的保护效果，说明CQ单独并不能增强pRBC lysate的免疫原性;但是，与alum+ pRBC lysate相比，alum+CQ+pRBC lysate能大幅度提高免疫小鼠的保护效果，说明CQ可能是通过alum增强pRBC裂解产物的免疫原性的。
　　2.CQ促进红内期P.y NSM灭活全虫疫苗抗红内期免疫的机制初探:
　　1)抗体是CQ增强红内期P.y NSM灭活全虫疫苗免疫原性的重要因素:小鼠经末次免疫两周后，流式检测小鼠的GC B细胞频率以及ELISA检测IgG浓度，发现alum+CQ+pRBC lysate免疫小鼠的GC B细胞频率和疟原虫特异性IgG滴度明显升高。为验证抗体在灭活全虫疫苗诱导的小鼠保护性免疫中的作用，在末次免疫两周后，分别收集alum+ pRBC lysate、alum+CQ+pRBC lysate免疫小鼠的血清，并过继转移到na(i)ve受体鼠体内，然后用等量的P.yNSM pRBC攻击，发现过继alum+CQ+pRBC lysate免疫血清的小鼠的原虫血症明显低于过继alum+ pRBC lysate的免疫血清。
　　2) CD4+T细胞是CQ增强红内期P.yNSM灭活全虫疫苗免疫原性的另一重要因素:小鼠经末次免疫两周后，FACS检测小鼠脾脏内疟原虫特异性CD4+T细胞的增殖能力以及IFN-γ的分泌水平，发现alum+CQ+pRBC lysate免疫小鼠CD4+T细胞的增殖能力更强且IFN-γ的表达明显高于alum+pRBC lysate免疫组。同时，小鼠末次免疫两周后，体内耗竭CD4+T细胞，然后用P.y NSM红内期疟原虫攻击。结果发现，体内拮抗CD4+T细胞后，alum+CQ+pRBC lysate免疫小鼠的原虫血症明显升高。
　　二、CQ并不能增强红内期P.y NSM灭活全虫疫苗的抗红外期效果
　　1.红内期P.y NSM灭活全虫疫苗能交叉抵御子孢子的攻击:红内期P.y NSM灭活全虫疫苗免疫后，用红外期子孢子攻击免疫小鼠后检测其肝期虫荷，与空白对照组相比，免疫小鼠的肝期虫荷明显降低;同时，检测免疫小鼠的红内期原虫血症，发现免疫小鼠的原虫血症明显低于空白对照组，说明红内期P.yNSM灭活全虫疫苗对红外期同样具有免疫保护作用。
　　2.CD8+T细胞而非CD4+T细胞在红内期P.y NSM灭活全虫疫苗抗红外期中起重要作用:末次免疫两周后，体内分别拮抗免疫小鼠体内的CD4+、CD8+T细胞，然后子孢子攻击检测其肝期虫荷以及原虫血症，发现体内拮抗CD4+T细胞后其肝期虫荷无显著变化;而体内拮抗CD8+T细胞后其肝期虫荷则明显升高。同时，CD8+T细胞拮抗组的红内期原虫提前2天出现，而CD4+T细胞拮抗组则无明显变化，说明CD8+T细胞而非CD4+T细胞在红内期P.y NSM灭活全虫疫苗抗红外期中起重要作用。
　　3.CQ并不能增强红内期P.y NSM灭活全虫疫苗的抗红外期效果:小鼠末次免疫后，子孢子攻击检测小鼠肝脏虫荷，发现CQ+灭活全虫疫苗免疫后小鼠的肝期虫荷与灭活全虫疫苗免疫组小鼠虫荷无明显差异，说明CQ并不能促进红内期P.y NSM灭活全虫疫苗抵御子孢子攻击。
　　综上所述，一定浓度的CQ能通过alum显著增强红内期全虫灭活疫苗的免疫保护效果，其中的机制与其能诱导机体产生强有效的体液免疫和CD4+T细胞反应相关。另外，红内期P.yNSM灭活全虫疫苗还能有效抑制肝期虫荷，对红外期同样具有免疫保护作用，但CQ并不能促进这种免疫保护。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 氯喹能明显促进红内期全虫疫苗的免疫保护效果

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 红内期P．y NSM灭活全虫疫苗对红外期的免疫保护

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 自噬影响机体适应性免疫应答的机制及进展

攻读学位期间发表的论文

致谢