HBV相关慢加急性肝衰竭的全基因组关联研究及主要位点HLA-DR功能解析

摘要

HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV-related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)是中国及亚太地区慢性肝病患者常见的危急重症，临床上表现为短期内出现高胆红素血症、凝血酶原时间延长（INR≥1.5），起病迅速，病死率高，缺乏特异治疗手段。
　　目前认为HBV-ACLF的发生主要与宿主遗传因素、病毒以及宿主免疫相互作用有关，但是其确切的发病机制尚不明确。近年来，西方基于酒精性肝硬化的ACLF的研究报道较多，认为酒精性肝硬化相关ACLF患者从急性发作、炎症损伤、免疫失调到系统性炎症反应综合征(systematic inflammatory response syndrome，SIRS)、代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)、再生反应等多环节事件的幅度和次序，决定着患者是炎症消退-康复还是进展到肝外器官衰竭，系统性炎症反应是酒精性肝硬化患者发生ACLF的主要驱动因素。
　　慢性HBV感染者是否发生肝炎发作，发作后是否进展为肝衰竭，由于HBV缺乏慢性感染的动物模型，且ACLF的病因和诱因存在很大的异质性，目前对HBV相关ACLF的肝脏免疫学应答及免疫病理过程仍然知之甚少。既往针对HBV病毒序列变异的研究认为C基因启动子区、前C区和C区变异与乙型肝炎的发作及暴发性肝衰竭相关。但是，同样的前C、C区变异既可以见于不同的病变表型（普通乙型肝炎、肝硬化、肝癌），也可见于无症状携带者。事实上，病毒变异是否导致乙型肝炎重症化的发生和发展，受到宿主因素的制约。乙型肝炎的发生、发展和转归，是病毒（病毒载量、变异、进化）和宿主（遗传异质性、年龄、性别等）通过免疫应答相互作用导致的常见复杂疾病。
　　常见复杂疾病(common complex diseases)通常由许多微效累加基因与环境因素共同作用而决定的。HBV-ACLF的发生、发展，涉及到免疫识别、炎症活化/放大、肝细胞坏死、SIRS、CARS、器官衰竭等多个环节，也属于常见复杂疾病的范畴，其遗传因素也涉及多个微效基因的作用。在复杂疾病遗传易感性研究中，关联研究-连锁不平衡分析方法最为常用，统计效能也远高于家系连锁分析。基于全基因组策略的遗传关联研究，是目前复杂疾病遗传关联研究的主流，与候选基因策略相比其优点在于统计效能有着极大的提高，同时可以避免群体分层偏倚和基因选择的偶然性，可以从全基因组角度获得复杂疾病遗传特征的全局、系统的认识。
　　开展HBV-ACLF表型的全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)，解析其全基因组范围内的宿主遗传位点及遗传关联图谱，有助于认识HBV-ACLF的驱动机制及干预靶点。因此，本课题在建立HBV-ACLF病例大样本、多中心队列的基础上，对其临床特征及炎症因子谱进行了分析，开展了HBV-ACLF的全基因组关联研究，并对主要关联位点HLA-DR进行了精细解析和功能注释，以及阳性关联HLA等位对HBV变异的限制性分析。本研究结果首次从全基因组角度明确了HBV-ACLF的主要遗传位点，提示HLA-DR等位限制性CD4+T细胞途径对HBV-ACLF的驱动作用。
　　本课题的主要研究结果如下：
　　1.共纳入1300例HBV-ACLF患者和2087例HBV无症状携带者进入3-stage的全基因组关联研究，样本来自重庆、北京、泉州、遵义、南宁5个中心。所有患者均无抗病毒史、无既往肝炎发作或肝功能失代偿病史。对1300例HBV-ACLF患者进行临床特征分析，LC-ACLF占60％左右，NLC-ACLF占40％;HBeAg阴性的HBV-ACLF占60％，HBeAg阴性并且HBV DNA＜104IU/mL的HBV-ACLF占17.1％。与LC-ACLF相比，NLC-ACLF患者表现为更年轻（平均年龄39.5vs.43.9岁，p=3.14×10-11）、更高的ALT水平（平均值1153vs.809IU/L，p=1.36×10-11）、腹水阳性率较低(58.7％vs.88.4％，p=9.25×10-35)、起病后更短时间内INR达到1.5及发生脑病(平均值分别19.8vs.24.8天，p=1.36×10-11;27.3vs.38.1天，p=5.16×10-6)。
　　2.对1013份患者血清样本进行35种细胞因子的多重定量检测，结果显示，国外酒精性肝硬化ACLF研究所关注的重要指标PCT（提示细菌感染）和CRP（提示肝外器官衰竭），在HBV-ACLF患者中其浓度低于普通慢性乙型肝炎(CHB)患者。与慢性乙型肝炎轻中度及重度相比，HBV-ACLF患者显著升高的细胞因子有6种：Th1型细胞因子IL-1a、TNF-β，Th2型细胞因子IL-5、IL-10和IL-13，Th17型细胞因子IL-17。
　　3.HBV-ACLF的GWAS初始阶段分析显示全基因组范围内1、6、12号染色体有显著的关联信号(p＜1×10-5)，LC-ACLF和NLC-ACLF两种亚型的共同遗传关联位点位于6号染色体HLA-Ⅱ区域。经过replication1a和1b独立样本验证表明HLA-DR区域是主要关联位点，再经过replication2a和2b验证，明确了rs3129859与HBV-ACLF显著相关(Pcombine=7.40×10-19，OR=1.83)。
　　4.分层分析显示rs3129859是HBV-ACLF的独立风险因素，与慢性乙型肝炎活动状态和HBV再活化无关。风险等位rs3129859*C与HBV-ACLF临床进程相关，携带风险等位rs3129859*C的ACLF患者和S-CHB患者，在入院28天时INR达到1.5及发生腹水的风险更高（分别有p=3.95×10-4，p=3.03×10-4）。在NLC-ACLF亚组，携带风险等位rs3129859*C的患者，28天死亡率更高(p=0.03)。
　　5.HLA-DRB1*1202等位是HBV-ACLF最显著的风险等位(p=3.94×10-6，OR=2.05)。HLA-DRB1*1202的全球分布与HBV-ACLF地理流行病学趋势一致，在中国(5.9-21.7％)和东南亚地区(6.8-35.3％)等位频率最高。
　　6.HLA-DRβ第28位氨基酸是最显著的关联氨基酸(p=3.03×10-6，OR=1.75)。其次，关联的氨基酸还包括HLA-DRβ蛋白第26、30、32、37、38和85位氨基酸，以及HLA-DQα蛋白第40、47、50、51、53、56、69、76位氨基酸和HLA-DQβ蛋白第45位氨基酸(p＜0.001)。蛋白结构三维重建显示这些关联氨基酸位于HLA分子抗原结合沟槽内。
　　7.等位单倍型rs3129859C-DRB1*1202-DQA1*0601-DQB1*0301和氨基酸单倍型DRβ-LEHHLLA-DQα-GCVLQdelTL-DQβ-E是风险单倍型，携带风险单倍型的HBV感染者，罹患ACLF的风险更高（additive model，分别p=1.16×10-4，OR=1.94;p=2.43×10-6，OR=2.10）。
　　8.生存分析提示风险等位及风险单倍型与HBV-ACLF临床进程相关。在非肝硬化ACLF亚组，携带风险单倍型rs3129859C-DRB1*1202-DQA1*0601-DQB1*0301的患者入院后28天(p=3.49×10-4)、90天(p=0.003)及180天(p=0.003)的死亡率更高，且肝性脑病发生率更高(p=0.019)，氨基酸单倍型也观察到一致的相关性。
　　结论：
　　1.我们的数据对于认识HBV-ACLF的自然史有重要意义：相当比例的慢性HBV感染者可在无肝硬化基础的情况下发生ACLF;HBV自然史处于低复制期和e抗原阴性期的患者，发生ACLF的风险不容忽视;NLC-ACLF的疾病进展更为迅速，HBV-ACLF发病年龄（42岁）远低于欧洲酒精性肝硬化ACLF患者（56岁）。
　　2.HBV-ACLF患者血清炎症因子谱分析表明HBV-ACLF患者确实存在剧烈的SIRS和CARS并存局面。HBV-ACLF患者CD4Th细胞因子通路剧烈活化，有别于慢性乙型肝炎轻中度和重度，也不同于欧洲酒精性肝硬化ACLF患者。
　　3.NLC-ACLF和LC-ACLF亚型具有共同的遗传易感位点，亚型位点、定量性状位点（肝酶、性激素等）与HBV-ACLF位点通路存在交互作用。
　　4.HLA-DR是HBV-ACLF的主要遗传易感位点，风险等位rs3129859*C和HLA-DRB1*1202可作为HBV-ACLF临床预警预后的marker。风险等位有特异限制的病毒变异位点，与肝炎活化、病毒正选择和表位漂移有关。
　　总之，本研究首次在HBV相关慢加急性肝衰竭患者中开展了全基因组关联研究，从全基因组范围内鉴定出HLA-DR是HBV-ACLF的主要关联位点，且关联的风险等位和单倍型与HBV-ACLF临床进程显著相关，提示了HLA-Ⅱ类分子限制的CD4+T细胞途径在HBV-ACLF的免疫病理过程中的重要作用，同时也表明肝硬化和非肝硬化基础的HBV-ACLF为同质性疾病，支持一个疾病的假说(one disease hypothesis)。

目录

声明

英文缩写一览表

摘要

第一章 前言

第二章 HBV-ACLF临床特征及炎症因子谱分析

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 HBV-ACLF的GWAS分析

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 关联位点的验证及主要位点精细解析

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

第五章 HLA-DRB1*1202风险等位对HBV变异的限制作用

5．1 材料与方法

5．2 结果

5．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 慢加急性肝衰竭：定义及病因变迁、病理生理机制及遗传因素研究进展

博士在读期间取得的研究成果

致谢