人参皂苷Rd对氧化低密度脂蛋白活化肝星状细胞的抑制作用及其机制的初步研究

摘要

肝纤维化是肝脏对各种致病因素导致的急性或慢性损伤进行的可逆性修复过程。肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)在肝纤维化发生发展中起到至关重要的作用，表现为HSCs由静止状态被激活并转分化为肌成纤维样细胞，随后肌成纤维样细胞大量增殖并过度合成细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，导致细胞外基质过度沉积。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是最重要的致纤维化细胞因子，TGF-β1不但可以直接激活HSCs引起Ⅰ型胶原及其他基质组分合成增加，还可以通过TGF-β/Smad信号通路促进ECM的生成和沉积，使肝细胞受损后不能再生。
　　CD36属于B族清道夫受体，在哺乳动物体内的多种细胞表面广泛表达，介导长链脂肪酸(fatty acids，FA)的摄取。CD36在正常肝内皮和间质细胞及库弗氏细胞中低表达，但是可以在禁食或某些转录因子被激活时被诱导高表达，从而增加肝脏对脂肪酸的摄取和甘油三酯的聚集。
　　自噬参与HSCs激活，通过分解受损细胞器，自噬可以为HSCs活化提供能量，促进HSCs的活化及纤维化的发展;自噬还能够通过分解肝细胞内脂滴参与脂质代谢，从而减轻肝脏炎症。
　　人参皂苷Rd(Ginsenoside Rd)为人参提取物中的稀有单体皂苷，有很强的生物学活性，在保护心脑血管、抗肿瘤、免疫调节及创伤修复等方面发挥独到的药理学作用。但人参皂苷Rd是否具有抗纤维化作用还鲜有研究。为此，本研究采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)活化HSCs为模型，探讨人参皂苷Rd在肝纤维化中的作用及其相关机制，为人参皂苷Rd成药提供思路。
　　方法:
　　1.MTT法检测人参皂苷Rd对HSCs活力和增殖的影响
　　96孔板中接种细胞，每组6个复孔。12小时后加药处理，继续培养24小时和48小时后加入MTT工作液，再继续培养4小时后加入DMSO终止液，摇匀后492nm测吸光度值。
　　2.ox-LDL活化HSCs
　　完全培养基培养细胞株HSC-T6，待细胞长至培养瓶底面积80％时，消化细胞并接种24孔板，12小时后加入10μg/ml ox-LDL，继续培养48小时。
　　3.实验分组及加药处理
　　实验分为4组:空白对照组、模型组、低剂量组、高剂量组;按照每孔2.5×105个细胞接种12孔板，12小时后按上述分组依次加入PBS、10μg/ml ox-LDL、10μg/mlox-LDL+20μmol/L Rd、10μg/ml ox-LDL+40μmol/L Rd，继续培养48小时。
　　4.胆固醇氧化酶终点法检测HSCs总胆固醇含量
　　细胞培养及加药处理后，离心收集细胞沉淀并分成两份，采用RIPA裂解液提取总蛋白和异丙醇加超声提取总胆固醇;采用BCA法测定蛋白总浓度，使用胆固醇(CHO酶法)试剂盒测定总胆固醇含量;以各分组细胞总胆固醇/各分组细胞总蛋白(mg/g)作为各分组细胞总胆固醇含量的比较。
　　5.油红染色法观察HSCs脂质摄入
　　孔板中细胞爬片及加药处理，4％多聚甲醛固定细胞，去离子水洗片，加入油红工作液避光染色，60％异丙醇漂洗后去离子水洗净，显微镜下观察拍照。
　　6.免疫荧光检测HSCs胶原蛋白表达
　　孔板中细胞爬片及加药处理，4％多聚甲醛固定细胞，免疫染色封闭液室温封闭，滴加Anti-CollagenⅠ抗体后于保湿盒中4℃避光孵育过夜;加入FITC标记羊抗兔IgG，室温避光孵育后DAPI染色，避光漂洗后加入抗荧光淬灭封片液，倒置荧光显微镜观察拍照。
　　7.RT-PCR法检测HSCs mRNA表达
　　总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，分光光度计测定RNA总浓度，逆转录合成cDNA;Real-time PCR检测TGF-β1和CD36mRNA表达;使用大鼠GAPDH作为内参，以2-△△Ct法计算各目的基因的相对表达量。
　　8.Western blot检测HSCs蛋白表达
　　RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白总浓度。SDS-PAGE分离样品蛋白后湿转至PVDF膜，5％脱脂奶粉室温封闭，4℃过夜孵育各蛋白抗体:CD36，collagen typeⅠ(COL1A1)，Smad2，Smad4，LC3Ⅱ，GAPDH;室温孵育二抗工作液;使用ECL发光液显影并曝光胶片，Quantity One分析软件进行条带灰度分析，各目的条带灰度值与GAPDH灰度值的比值作为各目的蛋白的相对表达量。
　　结果:
　　1.MTT实验结果显示，人参皂苷Rd在浓度低于40βM时对HSCs活力无影响;模型组的HSCs在培养24小时后略有增殖，但与空白对照组比较没有明显差异;低剂量组和高剂量组显著抑制HSCs增殖(p＜0.01)，与模型组比较有统计学意义;培养48小时后，模型组细胞增殖明显上升(p＜0.05)，而低剂量组和高剂量组明显抑制HSCs增殖（低剂量组:P＜0.05;高剂量组:P＜0.01），与模型组比较有统计学意义。
　　2.ox-LDL在10μg/ml时最大限度地持续活化HSCs，使其TGF-31mRNA表达和COL1A1蛋白表达显著上升(TGF-β1:P＜0.01;COL1A1:P＜0.05)，与空白对照组比较有统计学意义。
　　3.酶法检测HSCs总胆固醇含量结果显示，模型组细胞内胆固醇含量显著升高(P＜0.01)，与空白对照组比较有统计学意义;人参皂苷Rd处理后，低剂量组细胞内胆固醇含量变化不明显，而高剂量组细胞内胆固醇含量明显降低(P＜0.05)，与模型组比较有统计学意义。
　　4.油红染色结果显示，ox-LDL处理HSCs后，模型组细胞内脂滴蓄积，脂滴数量和含量均明显高于空白对照组;人参皂苷Rd处理后，与模型组比较，低剂量组细胞内脂滴数量略有减少，而高剂量组细胞内脂滴数量显著减少。
　　5.免疫荧光染色结果显示，模型组表达COL1A1蛋白的细胞数量和荧光强度均明显高于空白对照组;人参皂苷Rd处理后，与模型组比较，低剂量组细胞的荧光强度稍有降低，而高剂量组表达COL1A1蛋白的细胞数量和荧光强度均显著降低。
　　6.HSCs活化后，模型组CD36mRNA表达显著升高(P＜0.01)，与空白对照组比较有统计学意义;低剂量组和高剂量组的CD36mRNA表达显著升高(P＜0.01)，与空白对照组和模型组比较均有统计学意义。
　　7.ox-LDL活化HSCs后，模型组COL1A1蛋白、CD36蛋白、LC3Ⅱ蛋白表达均明显升高(COL1A1:P＜0.05;CD36:P＜0.01;LC3Ⅱ:P＜0.05)，与空白对照组比较均有统计学意义;模型组Smad2蛋白表达略有下降，Smad4蛋白表达有所增加，与空白对照组比较均无统计学差异。人参皂苷Rd处理后，低剂量组和高剂量组COL1A1蛋白表达均明显降低（低剂量组:P＜0.05;高剂量组:P＜0.01），与模型组比较有统计学意义;低剂量组CD36蛋白改变不明显，而高剂量组CD36蛋白表达显著降低(P＜0.01)，与模型组比较有统计学意义;低剂量和高剂量组Smad2蛋白表达均无明显改变，但高剂量组Samd4蛋白表达显著降低(p＜0.01)，与模型组比较有统计学意义;低剂量组和高剂量组LC3Ⅱ蛋白表达均明显降低（低剂量组:P＜0.05;高剂量组:P＜0.01)，与模型组比较有统计学意义。
　　结论:
　　1.低浓度ox-LDL可以持续活化HSCs，使HSCs TGF-β1mRNA表达和COL1A1蛋白表达显著升高。
　　2.人参皂苷Rd可能通过抑制CD36蛋白表达及减少脂质摄入来抑制活化的HSCs增殖和COL1A1蛋白表达而具有抗纤维化的作用。
　　3.人参皂苷Rd可能通过抑制TGF-β/Smad通路并降低细胞自噬对ox-LDL活化HSCs有抑制作用。

目录

声明

中英文缩略词表

摘要

第一章 前言

第二章 人参皂苷Rd对氧化低密度脂蛋白活化肝星状细胞的抑制作用及其机制的初步研究

2．1 材料与方法

2．1．1 仪器设备

2．1．2 实验材料及主要试剂

2．1．3 主要试剂的配置

2．1．4 实验方法及实验内容

2．1．5 统计学处理

2．2 结果

2．2．1 人参皂苷Rd对HSCs活力及活化后增殖的影响

2．2．2 ox-LDL活化HSCs

2．2．3 人参皂苷Rd对活化的HSCs总胆固醇含量的影响

2．2．4 油红染色观察人参皂苷Rd对活化的HSCs脂质摄入的影响

2．2．5 免疫荧光染色观察人参皂苷Rd对活化的HSCs COL1A1蛋白表达的影响

2．2．6 人参皂苷Rd对活化的HSCsCD36mRNA表达的影响

2．2．7 人参皂苷Rd对活化的HSCs COL1A1、CD36、Smad2、Smad4、LC3 Ⅱ蛋白表达的影响

2．3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 人参皂苷Rd的药理学研究进展

硕士在读期间发表论文

致谢