二甲双胍抑制GH3和AtT-20增殖及协同增强帕瑞肽对AtT-20的抑制作用

摘要

目的：
　　垂体生长激素(GH)腺瘤约占功能性垂体肿瘤的15％到20％，虽然大多为良性，其过度分泌生长激素在成人中能够引起肢端肥大症，在幼年期和青春期人群导致巨人症[1]。垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)腺瘤导致激素异常分泌引起库欣病，并能够引起一系列并发症[2]。手术切除肿瘤是垂体GH腺瘤和ACTH腺瘤患者的首选治疗方法，药物治疗主要用于术后疾病未缓解或复发患者的辅助治疗[2-5]。生长抑素类似物是治疗GH腺瘤和ACTH腺瘤的一线用药。其中奥曲肽治疗GH腺瘤已被临床广泛应用。同时，奥曲肽在一些研究中也被证实对治疗ACTH腺瘤治疗有效[6-8]，但是治疗效果的可重复性仍然具有争议[9]。帕瑞肽(Pasireotide)是一种新型的生长抑素类似物，针对库欣病人生化控制和临床改善上已经得到证实，但部分患者在治疗过程中伴发高糖血症[10-12]。
　　二甲双胍(Mefformin)作为常用的处方双胍类药物，能够有效安全地降低血糖而没有严重副作用，是治疗二型糖尿病的一线用药[13,14]。除了其降血糖的效果，最近也有报道称用二甲双胍治疗能够降低二型糖尿病病人的肿瘤发生率[15,16]。同时，在多个肿瘤细胞株中二甲双胍被证实具有抑制增殖的作用[17,18]，还能够增敏食道癌化疗药物的抗肿瘤效果和达沙替尼对头颈肿瘤的抑制效果[19-21]，但是二甲双胍对于垂体GH腺瘤和ACTH腺瘤的效果尚未见报道。本项目组前期在细胞实验中观察了二甲双胍对生长激素腺瘤细胞系GH3增殖和激素分泌的抑制作用。本实验研究通过裸鼠皮下移植瘤模型观察二甲双胍在体内对垂体腺瘤细胞系GH3的增殖和激素分泌的影响，并对可能存在的影响机制进行验证，同时利用体外细胞培养，研究二甲双胍对垂体ACTH腺瘤细胞系AtT-20的作用，以及是否具有协同增强帕瑞肽或奥曲肽抑制肿瘤细胞增殖的作用。
　　方法：
　　(1)用裸鼠GH3皮下移植瘤模型观察不同浓度二甲双胍处理组裸鼠的体重、肿瘤的大小变化，四周后收集裸鼠的血浆，利用ELISA技术检测GH浓度;收集荷瘤裸鼠的肿瘤，称重并提取蛋白质，利用Western Blot技术检测ATF-3、p-STAT3的变化，研究相关机制。
　　(2)应用CCK-8法检测二甲双胍、帕瑞肽和奥曲肽对细胞增殖的作用，以及联合应用二甲双胍和奥曲肽、联合应用二甲双胍和帕瑞肽后相比单用药细胞增殖的变化，应用联合指数(CI)法检测药物是否具有协同作用。利用基因芯片检测mRNA转录水平变化，探索协同增强的机制。
　　结果：
　　1.二甲双胍通过调节ATF3表达增加抑制垂体腺瘤GH3细胞系的增殖
　　裸鼠GH3皮下移植瘤治疗实验结果显示，接受100mg/kg每天口服强饲二甲双胍的100mg/kg组的肿瘤减少相对于纯水对照组无明显差异，接受300mg/kg每天口服强饲二甲双胍的300mg/kg组和接受500mg/kg每天口服强饲二甲双胍的500mg/kg组相比纯水对照组显著抑制肿瘤生长，表明二甲双胍抑制细胞系GH3的增殖。我们利用Western Blot技术检测ATF3在荷瘤裸鼠肿瘤组织中的表达，纯水对照组的ATF3表达均低于其他三组二甲双胍处理组ATF3表达(P＜0.05)，说明二甲双胍通过促进ATF3表达抑制GH3细胞增殖，与本项目组之前的体外实验结果一致。
　　2.二甲双胍通过抑制STAT3活性抑制垂体腺瘤GH3细胞系过度分泌生长激素
　　在裸鼠GH3皮下移植瘤治疗实验中，荷瘤裸鼠的体重相比正常裸鼠显著增加，与临床肢端肥大症病人特点相一致，而300mg/kg组和500mg/kg组的裸鼠体重的增加被减弱。同时，ELISA实验结果显示纯水对照组的荷瘤裸鼠相比正常裸鼠分泌更多的GH，而经过二甲双胍处理的荷瘤裸鼠能够反转GH的高分泌，证实二甲双胍抑制生长激素的过度分泌。
　　在利用Western Blot技术检测后，纯水对照组磷酸化的STAT3表达均高于其他三组二甲双胍处理组表达(P＜0.05，图1-6)，说明二甲双胍通过抑制STAT3活性抑制GH3细胞生长激素分泌，
　　3.二甲双胍能够抑制细胞系AtT-20增殖，能够协同增强帕瑞肽抑制AtT-20增殖
　　CCK-8实验结果显示在加入不同浓度二甲双胍处理72h后，与对照组相比，1mmol/L、2mmol/L和5mmol/L的二甲双胍均能明显抑制垂体瘤AtT-20细胞生长，并呈剂量依赖性(p＜0.05)。
　　无论是联合应用5μmol/L的奥曲肽和0.5mmol/L的二甲双胍，或者联合应用5μmol/L的奥曲肽和1mmol/L的二甲双胍，还是联合应用10μmol/L的帕瑞肽和1mmol/L的二甲双胍，联合用药组对细胞的抑制效果与单用二甲双胍组抑制效果无明显差异(p＞0.05)，提示二甲双胍与奥曲肽联合应用相比单用二甲双胍没有更好的抑制效果，临床上联合用药的意义不大。
　　在联用0.5mmol/L的二甲双胍之后，5μmol/L和10μmol/L的帕瑞肽的抑制效应相比单用帕瑞肽组和单用二甲双胍组更加明显(p＜0.05)，同样的，将不同浓度（0.5mmol/L和1mmol/L）的二甲双胍与5μmol/L的帕瑞肽联合应用，相比单用5μmol/L的帕瑞肽和单用二甲双胍，对细胞增殖的抑制效应也明显增加(p＜0.05)。联合应用5μmol/L的帕瑞肽和0.5mmol/L的二甲双胍、联合应用5μmol/L的帕瑞肽和1mmol/L的二甲双胍、联合应用10μmol/L的帕瑞肽和0.5mmol/L的二甲双胍，其效应CI值分别为0.740、0.499、0.536，均远小于1，表示二甲双胍能够协同增强帕瑞肽对AtT-20的抑制效果。
　　4.二甲双胍可能通过上调Coq3、Cox6a2、P2ry6等基因，下调Palmd、Eya2、Il17rb等基因协同增强帕瑞肽抑制AtT-20增殖
　　分别用1mmol/L的二甲双胍、5μmol/L的帕瑞肽或者将两者联合应用来处理细胞，72小时后，与未加任何处理的对照组细胞一起，通过基因检测，发现对比单用5μmol/L的帕瑞肽处理的细胞，通过联合用药处理的细胞，Coq3、Cox6a2、P2ry6等900个差异表达基因显著上调，Palmd、Eya2、Il17rb等1035个差异表达基因显著下调，表明二甲双胍可能通过调节这些基因协同增强帕瑞肽对AtT-20增殖的抑制效果，具体机制有待进一步实验研究。
　　结论：
　　1.二甲双胍通过调节ATF3表达增加抑制垂体腺瘤GH3细胞系的增殖，通过抑制STAT3活性抑制垂体腺瘤GH3细胞系过度分泌生长激素。
　　2.二甲双胍抑制AtT-20细胞增殖，并可能通过上调Coq3、Cox6a2、P2ry6等基因，下调Palmd、Eya2、Il17rb等基因协同增强帕瑞肽抑制AtT-20增殖。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 二甲双胍抑制垂体腺瘤GH3细胞系增殖及激素分泌的体内实验研究

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 二甲双胍抑制AtT-20细胞增殖并协同增强帕瑞肽治疗效果的实验研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 老药新用：二甲双胍的抗肿瘤活性

学习期间发表和待发表的论文

致谢