砂仁挥发油治疗胃肠黏膜炎性疾病的免疫药理研究

摘要

研究背景： 砂仁是姜科植物阳春砂Amomumvillosumlour.、海南砂AmomumlongiligulareT.L.Wu.或绿壳砂Amomumvillosumlour.var.xanthioidesT.L.WuetSenjen的干燥成熟果实。以广东阳春县所产阳春砂最著名，称为地道南药砂仁。砂仁在中医治疗胃肠道疾病中应用非常普遍，具有确切的医疗价值，可治疗胃和十二指肠溃疡、肠炎、小儿腹痛、慢性腹泻、胃痛、腹泻、腹胀、胃无力等胃肠道疾病。砂仁含挥发油高达1.7-3％，因此砂仁研究重点多为其挥发油成份。 近年来对砂仁的化学成分和药理活性研究日趋深入，但对治疗胃肠道疾病的作用机理尚未明确。国内对砂仁治疗胃肠道疾病的文献报道很多，大多集中于砂仁对胃肠道动力影响的观察，对药理机制的研究也仅见砂仁对胃肠激素影响的检测。本研究将以胃溃疡(GU)和炎症性肠病(IBD)两种疾病为研究的切入点，从其细胞和分子机制出发，探讨砂仁挥发油对胃肠黏膜炎症的作用和免疫药理机制。 胃溃疡是发生于贲门和幽门之间的溃疡黏膜缺损超过黏膜肌层的一种消化性溃疡，在人群中发病机率很高。胃黏膜损伤和溃疡的形成伴随着生长因子在黏膜的表达，致炎细胞因子的诱生，以及血管活性物质、一氧化氮(NO)和内皮素的产生。胃溃疡的愈合是一个非常复杂的过程，涉及到坏死物质的清除，肉芽组织的生长，细胞移行、分化、增殖和细胞外基质形成，新生血管生成，纤维组织和疤痕组织的形成以及上皮重构等过程。有研究表明，一些与胃酸分泌、细胞移行、分化、增殖和细胞外基质形成及新生血管生成有关的细胞因子和生长因子参与了溃疡的愈合，另外氧自由基和NO在溃疡的损伤和愈合中也起着很重要的作用。 炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，是一种以肠道炎症和黏膜组织损伤为特征的肠道非特异性炎症疾病，其产生的肠内、肠外症状严重影响了病人的生活质量，其发病率和癌变率在我国逐年上升。IBD的确切病因未明，但有充分的证据表明：易感基因、环境因素和黏膜免疫系统之间的复杂交互效应是引起IBD的主要原因。目前，免疫因素在IBD的发病学中最为肯定，很多证据表明循环和肠道局部细胞因子表达异常与IBD的发病及转归密切相关。与IBD关系密切的有致炎细胞因子和抗炎细胞因子，致炎细胞因子和抗炎细胞因子功能、数量异常或两类因子之间的失衡，可引起和放大黏膜的炎症，进一步加重肠黏膜的损伤。此外，肠上皮细胞和淋巴细胞的凋亡也参与了IBD的发病过程，IBD患者的结肠黏膜凋亡细胞数异常增多导致溃疡病变的形成，因此在IBD的发病机制中凋亡可能具有重要意义。 研究目的： 本研究采用水蒸气蒸馏法从阳春砂仁中提取出挥发油成分，对建立的胃溃疡和结肠炎两种动物模型采用灌胃给药法治疗，观察砂仁挥发油对损伤黏膜愈合的影响，以及循环和肠道局部的细胞因子和生长因子的水平、胃肠道相关炎症介质的变化以及肠黏膜细胞凋亡的变化，探讨砂仁对慢性胃肠道疾病的抗炎作用和免疫药理机制，为砂仁在胃肠道疾病的治疗奠定基础，进而为将砂仁开发为有效的临床制剂提供理论基础。 研究内容和方法： (一)砂仁挥发油的提取、质量控制和急性毒性实验研究 采用水蒸气蒸馏法从阳春砂果实中提取挥发油成分，用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析砂仁挥发油的化学组成，并采用气相色谱法(GC)检测砂仁中乙酸龙脑酯的含量，以此作为挥发油的质量控制标准。另外，我们对砂仁挥发油进行了小鼠的急性毒性实验，以确定砂仁挥发油的半数致死量(LD50)，为药理评价提供剂量设计的依据。 (二)砂仁挥发油对乙酸性胃溃疡大鼠的治疗作用及其免疫机理研究 采用乙酸直接接触浆膜的方法建立乙酸性胃溃疡的动物模型，将50只大鼠随机分为正常对照组、胃溃疡模型组、法莫替丁组、砂仁挥发油高剂量组和砂仁挥发油低剂量组，每组10只。造模后第3d开始给药，正常组和模型组给予0.9％氯化钠溶液90mg/(kg·d)，法莫替丁组给予法莫替丁4mg/(kg·d)，砂仁挥发油高、低剂量组分别给予砂仁挥发油乳剂300mg/(kg·d)和75mg/(kg·d)。给药10d后处死，观察砂仁挥发油对胃溃疡大鼠的大体形态学、溃疡面积和体重的影响，并观察其对胃溃疡大鼠的组织病理学方面的影响，同时检测大鼠外周血中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)浓度和一氧化氮(NO)浓度的变化。采用液相芯片(luminex)技术检测了砂仁挥发油对血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-4(IL-4)在胃溃疡大鼠外周血清中的变化，并使用免疫组化方法对表皮生长因子(EGF)在大鼠胃黏膜组织中的表达情况进行了观察，来探讨砂仁挥发油对胃溃疡大鼠胃黏膜的作用机理。 (三)砂仁挥发油对大鼠实验性结肠炎慢性炎症期的治疗作用及其免疫机理研究将58只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、结肠炎模型组、SASP组、砂仁挥发油高剂量组和砂仁挥发油低剂量组。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠法制作大鼠实验性结肠炎模型，造模后第7d开始给药。正常组和模型组给予0.9％氯化钠溶液0.09g/(kg·d)，阳性对照组给予柳氮磺吡啶片(SASP)4mg/(kg·d)，砂仁挥发油剂量组给予砂仁挥发油乳剂300mg/(kg·d)和75mg/(kg·d)。给药14d后处死，通过观察砂仁挥发油对各组大鼠的生存率、结肠宏观表现、病理学变化、结肠湿重、大体损伤分数、腹泻和粘连的情况，评价其对结肠黏膜损伤愈合的影响；检测结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)活性、SOD活性及MDA含量的变化，以判断炎症的严重程度和砂仁挥发油抗氧化的作用。并用luminex技术同时检测结肠中的三种细胞因子：白介素-2(IL-2)、IL-4和TNF-α水平的影响，采用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)法检测挥发油对结肠黏膜细胞凋亡的影响，探讨砂仁挥发油对IBD作用的相关机制。 (四)统计学处理方法 所有数据采用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。各组检测结果计量资料采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，并进一步做多重比较。生存率的比较采用x2检验(Chi-SquareTest)。显著性水平为：α=0.05。 结果结论： 1.本实验采用水蒸气蒸馏法从阳春砂仁中提取挥发油，其得率为3.54％，在提取的砂仁挥发油中，共分离出96个化学成分，鉴定出其中63个成分，已鉴定的成分占挥发油总量的98.08％。主要为单萜类和倍半萜类化合物，还有非萜类小分子的芳香族和脂肪族化合物。挥发油中含量大于1％的有乙酸龙脑酯、樟脑、柠檬烯、樟脑烃、龙脑、β-蒎烯、β-月桂烯和α-蒎烯8种化合物。急性毒性实验得出砂仁挥发油对小鼠灌胃的LD50为7200mg/Kg，按毒性分级标准，属实际无毒类物质。 2.砂仁挥发油对胃溃疡大鼠的溃疡愈合具有促进作用。可以改善胃溃疡大鼠精神不振、倦怠嗜卧的症状，减轻胃溃疡大鼠胃黏膜的组织病理学损伤。砂仁高、低剂量组均可以提高大鼠血清SOD值、NO含量和VEGF含量，减少大鼠血清MDA值；砂仁挥发油低剂量组的大鼠血清中IL-4水平显著提高，砂仁高、低剂量组对血清中TNF-α水平没有显著影响。EGF的表达部位在胃黏膜腺体的颈部，以壁细胞、颈部细胞胞浆表达为主，砂仁挥发油的高、低剂量组的大鼠EGF表达均为阳性。 3.砂仁挥发油对结肠炎大鼠结肠黏膜炎症具有改善作用。可以降低大鼠结肠湿重和大体损伤分数，改善大鼠腹泻的情况；同时减轻结肠炎大鼠结肠黏膜的病理组织学损伤。砂仁挥发油低剂量组可提高结肠SOD活性和MPO活性，同时使MDA含量显著下降；砂仁挥发油高、低剂量组可下调造模后大鼠结肠黏膜中升高的致炎细胞因子TNF-α和IL-2的水平，并且上调抗炎细胞因子IL-4的水平；砂仁挥发油可降低大鼠结肠黏膜过度增多的凋亡细胞数目，凋亡主要发生在病变处及临近的非病变处隐窝上皮细胞。 综上所述，本课题在建立胃溃疡和炎症性肠病两种动物模型的基础上，采用阳春砂仁挥发油灌胃给药，观察其对上述两种胃肠黏膜炎性疾病的作用，并从免疫学角度探讨其作用机制。研究结果表明：砂仁挥发油对大鼠乙酸性胃溃疡和实验性结肠炎均具有缓解炎症和促进溃疡愈合的作用，其机制可能和清除过量氧自由基，调控致炎和抗炎细胞因子的平衡，促进胃黏膜生长因子EGF的表达，以及下调结肠的异常细胞凋亡有关。

目录

文摘

英文文摘

第一章砂仁挥发油的提取、质量控制和急性毒性实验研究

第二章砂仁挥发油对大鼠乙酸性胃溃疡的治疗作用及其免疫机理研究

第三章砂仁挥发油对大鼠实验性结肠炎慢性炎症期的治疗作用及其免疫机理研究

结论

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢

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