聚乙二醇化干扰素α-2a与干扰素α-2a在体内和体外的抗乙型肝炎病毒活性研究

摘要

乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科，具有严格的种属和组织特异性，它只传染人和类人猿等灵长类动物，或者是这些动物的原代培养肝细胞。病毒与靶细胞受体结合进入体内，在肝细胞特异性细胞因子作用启动病毒复制。 1．重组腺病毒的生物学特征的鉴定利用所构建的具复制能力的HBV重组腺病毒传染体外培养肝细胞，观察HBV的表达情况，从而初步了解该重组HBV腺病毒的生物学特性。 重组腺病毒传染细胞后，连续七天在细胞内均可检测到腺病毒载体，证明了重组腺病毒对细胞的易感性和高效的基因转移能力。重组腺病毒传染细胞后第三天可以在培养上清中检测到腺病毒基因，随着培养时间的延长，培养上清中腺病毒含量增加。可能是随着培养时间的延长，细胞增殖到一定程度后开始老化、死亡、脱落，从而使部分重组腺病毒释放进培养上清中。 2．重组腺病毒传染L02细胞后HBV复制的动态分析将重组腺病毒介导的具自行复制能力的HBV传染人正常肝细胞株L02，获得能表达HBV标志物的细胞模型，应用酶联免疫技术动态观察L02细胞内HBsAg和HBeAg的表达；HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBV DNA载量； 以不含蛋白酶的裂解液裂解细胞，利用cccDNA和rcDNA与蛋白质结合能力的差异提取cccDNA，并以绿豆核酸酶消化残留的rcDNA；利用cccDNA和rcDNA结构上的差异，设计跨越负链缺口的引物，并通过荧光定量PCR检测cccDNA，探讨重组腺病毒传染L02细胞后细胞内cccDNA的变化。 以病毒含量分别为10<'7>、10<'6>拷贝/ml的乙型肝炎患者血清进行引物的特异性检测，结果均为阴性，证明引物对HBV cccDNA具有特异性。 质粒标准品倍比稀释为10<'2>，10<'3>，10<'4>，10<'5>，10<'6>，10<'7>拷贝/ml进行引物的敏感性检测，质粒在10<'3>-10<'7>范围内均能检测到信号，因此，该方法的敏感性可以达到10<'3>拷贝/ml。 以该特异性引物进行荧光定量PCR检测重组腺病毒传染后L02细胞后细胞内cccDNA的量，cccDNA在传染后一天即可在细胞内检测到，第四天达到高峰，随后呈下降趋势，但仍维持相对稳定状态。认为cccDNA的稳定维持在一定水平，既能满足病毒复制的需要，又不会对细胞产生毒性，有利于维持病毒对细胞的长期传染状态。 HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBV DNA，培养上清中HBV DNA含量在病毒传染细胞后第五天达到最高，随后维持稳定状态。 ELISA检测培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌，HBsAg和HBeAg的表达量随培养时间的延长而增加，第六天达到高峰，随后呈下降趋势。一是由于细胞生长已到达平台期，细胞内已建立一种稳定的病毒传染状态；二是随着时间的延长，培养的细胞几乎停止分裂生长，细胞合成代谢功能降低，出现老化现象，因此完全依赖于细胞功能才能进行复制和表达的病毒，其复制水平也会随之下降。对。HBV cccDNA、HBV DNA、HBsAg和HBeAg进行Spearman相关性分析，培养上清中HBV DNA的量与HBsAg和HBeAg的分泌量之间存在正相关关系，分别为：r<,s>=0.881，P=0.004(双侧)；r<,s>=0.857,P=0.007(双侧)，从而认为HBV蛋白表达规律与培养上清中HBV DNA相关，而细胞内HBV cccDNA与培养上清中HBV DNA的量及HBsAg和HBeAg的分泌量之间无明显相关性(P>0.05)。 3．IFNa-2a与Peg-IFNa-2a在体外对HBV复制的影响以重组腺病毒传染的L02细胞为细胞模型，通过观察IFNa-2a与Peg-IFNa-2a处理前后培养上清HBV DNA、细胞内HBV cccDNA、HBsAg与HBeAg的变化，比较。IFNa-2a与Peg-IFNa-2a的体外抗病毒作用，并观察该两种干扰素对乙型肝炎病毒复制的第一个环节有无抑制作用。 以MTT法进行细胞毒性检测，在本实验浓度下，IFNa-2a与Peg-IFNa-2a对腺病毒传染的L02细胞均无细胞毒性作用(P>0.05)。 结果显示，Peg-IFNa-2a药物组中，三个药物浓度组处理的细胞中HBsAg及HBeAg与对照组比较，均无显著性差异(P>0.05)。IFNa-2a药物组中，剂量为100 IU/ml组的细胞分泌的HBsAg及HBeAg与对照组比较，无显著性差异(P>0.05)；剂量为500 IU/ml组及1000 IU/ml组的细胞分泌的HBsAg及HBeAg与对照组相比显著减少(P<0.05，P<0.001)，认为IFNa-2a在剂量为500 IU/ml以上时对重组腺病毒传染的L02细胞的HBV抗原分泌有抑制作用。 HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBV DNA及应用HBV cccDNA特异性引物进行荧光定量PCR检测细胞内cccDNA含量。Peg-IFNa-2a药物组中，三个药物浓度组处理的细胞培养上清中HBV DNA含量与对照组比较，均无显著性差异(P>0.05)。IFNa-2a药物组中，剂量为100 IU/ml组的细胞培养上清中HBV DNA含量与对照组比较，无显著性差异(p>0.05)；剂量为500 IU/ml组及1000 IU/ml组的细胞培养上清中HBV DNA含量与对照组相比显著减少(P<0.05)，认为IFNa-2a在剂量为500 IU/ml以上时对重组腺病毒传染的L02细胞内HBV DNA的合成有抑制作用。比较各组细胞内HBV cccDNA，各药物组细胞与对照组细胞的cccDNA含量均无显著性差异(p>0.05)，认为短期的药物处理不能抑制细胞内cccDNA的合成。 4．IFNa-2a与Peg-IFNa-2a在体内对HBV复制的影响利用重组腺病毒传染小鼠，使HBV基因在小鼠体内表达，构建HBV传染的小鼠模型，利用该模型研究IFNa-2a和Peg-IFNa-2a的体内抗病毒作用，并观察IFNa-2a与Peg-IFNa-2a对小鼠体内HBV cccDNA的清除是否存在差异。 重组腺病毒以尾静脉注射的方法接种4周龄的昆明小鼠，接种剂量为2×10<'9>pfu，建立HBV传染的动物模型。分别以IFNa-2a与Peg-IFNa-2a对小鼠进行皮下注射，参照人体临床用药，IFN α-2a用药剂量为1.7×10<'3>IU/只，三次/周；Peg-IFNa-2a用药剂量为0.06μg/只，一次/周；以生理盐水为对照组，一次/周。分别于第4周和第8周观察腺病毒介导的HBV在小鼠体内的复制情况及药物对HBV在体内复制的影响。提取两个药物组和对照组传染小鼠血清DNA及肝脏DNA，以HBV特异性引物进行PCR检测，传染小鼠血清及肝脏中结果均为阳性。 以腺病毒特异引物进行PCR反应，检测传染小鼠血清及肝脏中的腺病毒基因组。第4周时三组传染小鼠肝脏中均可检出腺病毒DNA，第8周时再次检测传染小鼠肝脏中腺病毒DNA，结果均为阴性；而三组传染小鼠血清中一直不能检测出腺病毒DNA。结果表明，小鼠血清中不含重组腺病毒，血清中的HBVDNA是由于病毒在体内复制而产生的子代病毒。 采用ELISA法检测了小鼠血清中IFN-丫含量，各实验组间IFN-丫含量比较有显著性差异(P<0.001)，但不同时间(第4周和第8周)各组IFN-丫含量比较无显著性差异(P>0.05)。各实验组进行两两比较，结果表明，Peg-IFNa-2a组和IFNa-2a组与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)；比较两个药物组之间所诱生的IFN-丫的含量，Peg-IFNa-2a组高于IFNa-2a组(P<0.05)。认为Peg-IFNa-2a与IFNa-2a在体内均具有免疫调节能力，但Peg-IFNa-2a的免疫调节作用强于IFNa-2a。 荧光定量PCR检测小鼠血清HBV DNA，比较各实验组小鼠血清中的病毒含量变化，结果显示，两个药物组与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)，表明两个药物对小鼠血清中病毒均有抑制作用。两个药物组之间比较无显著性差异(P>0.05)；各实验组中血清病毒载量在第4周与第8周的差异无显著性(P>0.05)，从而认为Peg-IFNa-2a与IFNa-2a在本实验时间范围内对小鼠血清中病毒的作用无差异。传染小鼠肝脏DNA以绿豆核酸酶处理，以HBV cccDNA特异性引物进行荧光定量PCR检测传染小鼠肝脏中HBV cccDNA含量。结果显示，第4周与第8周时三组传染小鼠肝脏中HBV cccDNA含量均无显著性差异(P>0.05)。从而认为IFNa-2a与Peg-IFNa-2a虽然能抑制血清中的病毒复制，但对肝脏内HBVcccDNA的影响不显著。 结论：建立复制型HBV重组腺病毒的体外传染和体内传染模型。重组腺病毒在体外培养细胞中可以表达HBV、HBsAg和HBeAg，并可检测出HBV复制中间体。重组腺病毒传染小鼠，可以在小鼠体内检测到HBV复制中间体。利用该模型分别在体外和体内进行抗HBV活性的比较，IFNa-2a的体外抗病毒作用比Peg-IFNa-2a强；在体内，Peg-IFNa-2a具有较强的免疫调节能力；两个药物均能抑制血清中HBV的复制，但却对肝脏内HBV cccDNA的合成影响不大。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分重组腺病毒的生物学特性研究

1.材料和方法

2 结果

3 讨论

第二部分重组腺病毒传染L02细胞后HBV cccDNA的动态分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三部分Peg-IFNα-2a与IFNα-2a对重组腺病毒感染L02细胞后HBV复制的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第四部分Peg-IFNα-2a与IFNα-2a对重组腺病毒感染小鼠体内HBV复制的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢