H9N2亚型禽流感病毒进化分析及H5N1亚型禽流感变异株疫苗株的构建

摘要

H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛流行,不仅给养禽业造成了巨大的经济损失,而且对人类健康造成威胁.我国在1994年从广东省某鸡场中分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒,此后,该亚型禽流感病毒迅速在国内蔓延,给养禽业造成了严重危害. 本实验室李呈军等人对H9N2亚型禽流感病毒1996～2002年国内分离株进行了系统的遗传演化分析,所观察到的病毒都是起源于CK/BJ/1/94-like病毒,并且在进化过程中发生了复杂的基因重组.为了持续观察国内H9N2亚型禽流感病毒的变化方向,本研究对2003～2004年中国大陆分离到的13株具代表性的H9N2亚型禽流感病毒进行序列测定和遗传演化分析.发现其中11株病毒的HA基因属于CK/BJ/1/94群系,NA基因属于CK/BJ/1/94或DK/HK/G9/97群系,说明CK/BJ/1/94群系病毒仍是我国H9N2病毒流行的最主要类型.而另外两株病毒HA和NA基因均属于G1群系:同时,我们对其中一株G1群系病毒QA/GD/125/03进行了全基因测序,通过遗传分析发现其为G1群系病毒和其它群系病毒的自然重组毒株,表明G1亚群病毒至少是该亚群病毒的一些基因节段在我国家禽中仍然存在并己进入鸡群.而且这些类G1病毒具有不同的抗原性以及人流感病毒的受体结合位点.本研究结果强调应对H9N2病毒的防治及其公共卫生意义予以高度重视. 流感病毒血凝素受体结合位点特性与病毒宿主特异性密切相关.本研究13株病毒中有9株病毒的血凝素226位氨基酸为L,使病毒能与人类细胞中的α-2,6半乳糖苷键连接的唾液酸受体结合.特别是两株G1亚群病毒CK/GD/123/03和0A/GD/125/03的H183,E190,L226组合,呈现了典型的人流感病毒受体结合位点特性,与1997年香港禽流感病毒感染人事件发生时从鹌鹁中分离的.A/QA/HK/G1/97(H9N2)和1999年香港女童中分离到的毒株A/HK/1073/99(H9N2)以及早期H3N2亚型人流感病毒相同.HA头部受体结合位点附近新增两个潜在糖基化位点,有可能改变病毒的抗原性并影响受体结合特性而感染新的宿主,并进一步对人类公共卫生造成威胁. 某些在同一地区不同种类家禽体内分离到的病毒具有很高的同源性,表明当H9N2亚型禽流感病毒进入某一地区后,常会引起该地区多种家禽同时感染,并且由于它的低致病性而使其更易长期在家禽间传播,增加了防控难度. G1亚群H5Nl亚型高致病性禽流感的爆发给世界养禽业造成毁灭性打击,而且具有重要的公共卫生学意义.疫苗免疫是预防高致病性H5N1亚型禽流感的重要防线.流感病毒反向遗传操作系统的建立为流感病毒疫苗研制提供了有力工具. 利用我国分离的第一株H5N1亚型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96制备的重组灭活疫苗在我国广泛应用,为我国禽流感疫情的防控工作做出了巨大贡献.然而,自2006年以来,在国内某些地区陆续分离到一些H5Nl亚型禽流感病毒抗原变异株,使用疫苗免疫后的鸡群仍不能抵御这些病毒的感染.因此,我们有必要针对这些抗原变异株制备新的疫苗以阻止禽流感病毒的感染和蔓延. 本研究人工救获了H5N1亚型重组流感病毒株H5N1(SX)/9R8.其HA和NA基因来源于我国分离的H5Nl亚型高致病性禽流感病毒抗原变异株A/Chicken/Shanxi/2/2006(CK/SX/2/06),使疫苗株具有与国内变异株相一致的抗原性.六个内部基因来源于高滴度鸡胚适应株A/PuertoRico/8/34(PR8),使病毒具有高滴度鸡胚生长特性.通过分子修饰去除了HA基因裂解位点的多个连续的碱性氨基酸,使其具备了低致病性禽流感病毒的HA基因特征,令疫苗更具安全性. 利用该重组毒株制备的全病毒灭活疫苗在通过了本实验室后续的生物学特性和安全性试验后,证实其具有理想疫苗的所有特点并迅速投入生产应用,对这一抗原群病毒引发的高致病性禽流感疫情防控起到了关键性作用.

目录

文摘

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第一章引言

1.1禽流感病毒生物学特性

1.1.1禽流感病毒的组成和复制

1.1.2 HA和NA基因功能

1.1.3内部基因功能

1.2流感的历史及其流行现状

1.2.1高致病性禽流感

1.2.2低致病性的H9N2亚型禽流感

1.2.3公共卫生意义

1.3禽流感疫苗

1.3.1灭活全病毒疫苗

1.3.2亚单位疫苗

1.3.3重组活载体疫苗

1.3.4 DNA疫苗

1.3.5反向遗传操作疫苗

1.4反向遗传操作技术及其在流感病毒研究中的应用

1.4.1反向遗传学和反向遗传操作技术

1.4.2流感病毒反向遗传操作系统的发展过程

1.5本研究的目的和意义

第二章H9N2亚型禽流感病毒表面蛋白基因遗传演化分析

2.1材料和方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果

2.2.1序列测定结果

2.2.2 HA基因遗传分析

2.2.3 NA基因遗传分析

2.2.4 QA/GD/125/03全基因组分析

2.3讨论

第三章H5N1亚型禽流感病毒重组灭活疫苗的构建

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果

3.2.1 pBD-MutHA质粒的构建

3.2.2 H5N1(SX)/PR8的救获和病毒鉴定

3.3讨论

第四章结论

参考文献

附录

致谢

作者简历